一株高活性纖維二糖酶真菌的篩選與鑒定

尹守亮，楊鎰嬰，徐黛云，劉瑤，儲(chǔ)鑫越，李秋園，周志江

(1. 天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300072；2. 華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；3. 中溶科技股份有限公司博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河北 唐山 064000)

纖維二糖酶(cellobiase)又稱β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，3.2.1.21)，能夠催化多種葡萄糖苷衍生物非還原末端的β-D-葡萄糖苷殘基水解，它普遍存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中，在各種生物的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外產(chǎn)生和發(fā)揮功能[1]。當(dāng)前，纖維二糖酶在化妝品、紡織、洗滌劑、動(dòng)物飼料、煙草和食品工業(yè)、有機(jī)化學(xué)合成、天然聚合物修飾、醫(yī)學(xué)診斷以及廢紙脫墨等方面有著廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[2]。

纖維素是由D-葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的可生物降解、可再生的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的聚合物[3, 4]。纖維素是自然界中最豐富的多糖，也是農(nóng)業(yè)廢棄物中比例最高的組成部分。全世界范圍內(nèi)科學(xué)家普遍共識(shí)：纖維素是最寶貴的可再生能源和原材料，通過生物酶降解其為單糖葡萄糖，能將纖維素廢棄物有效地轉(zhuǎn)換為高附加值產(chǎn)品，如燃料乙醇等，這對(duì)開發(fā)可持續(xù)生物燃料等資源具有重要的意義[5]。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外多家高校、科研院所和企業(yè)公司一直致力于纖維二糖酶的研究，期望能夠更好地改善纖維素酶的催化效率，有效且充分地利用廉價(jià)的纖維素資源。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種著名的產(chǎn)纖維素酶真菌，最早被作為研究纖維素降解機(jī)制的模式菌，其合成的纖維素酶主要包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-D-glueanase，EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-D-glucanase，EC3.2.1.91)和纖維二糖酶。纖維素的完全降解需要這3種酶的共同參與，其中纖維二糖酶是纖維素分解酶系中的一個(gè)重要組分，它負(fù)責(zé)木質(zhì)纖維素水解的最后一步，將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖[6]。里氏木霉自身合成纖維二糖酶的產(chǎn)量較低，外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶含量>92%，因此，纖維二糖酶是纖維素降解過程中的限速酶，極大程度上限制了纖維素酶實(shí)際在工業(yè)化上的應(yīng)用[7, 8]。

從唐山市曹妃甸濕地腐敗草叢里采集土壤樣品，利用纖維二糖作為唯一碳源篩選到一株編號(hào)CB21的桔青霉真菌，其粗酶液中纖維二糖酶活性最高是里氏木霉纖維二糖酶活力的11.3倍，該研究篩選的高活性纖維二糖酶產(chǎn)生菌CB21為提高農(nóng)業(yè)纖維素廢棄物的利用效率提供了備選研究菌種。

1材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌克隆宿主DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。EZ-Blunt pTOPO平末端克隆試劑盒和SuperStar Max超保真DNA聚合酶購于北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司，纖維二糖(Solarbio，G8580)、水楊苷(Solarbio，S9720)、LB肉湯培養(yǎng)基(Solarbio，L8291)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Solarbio，P8931)、真菌基因組DNA提取試劑盒(Solarbio，D2300)等均購于北京索萊寶科技有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒(OMEGA，D6943-01*)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA，D2500-01)、3,5-二硝基水楊酸(上海國(guó)藥試劑集團(tuán))和乳酸酚棉藍(lán)染色液(青島海博生物技術(shù)有限公司)均購于代理商北京江晨文軒生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器

快速梯度PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，A300)，可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，V-5000)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，IX73-DP80)。

1.3 培養(yǎng)基

纖維二糖唯一碳源培養(yǎng)基[9]: KH2PO415 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO40.6 g/L, CaCl20.8 g/L, MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.000 5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L，CoCl20.000 2 g/L, 纖維二糖 10 g/L, 瓊脂粉20 g/L，pH 4.8。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基參照孟慶山文獻(xiàn)方法[9]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 利用纖維二糖作為唯一碳源篩選纖維二糖酶活性菌

從華北理工大學(xué)(曹妃甸校區(qū))校園里腐敗的草叢里采集土壤樣品，用無菌水浸泡后梯度稀釋涂布到含有纖維二糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d，挑選長(zhǎng)出的單菌落并在篩選培養(yǎng)基中傳代和復(fù)篩，將復(fù)篩能在纖維二糖碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株，傳代劃線至PDA復(fù)合培養(yǎng)基中進(jìn)行富集和收集孢子。將0.1 ml孢子懸液(1.0×106個(gè)/ml)分別接種到種子培養(yǎng)基中(250 ml三角瓶中加入 50 ml培養(yǎng)基)，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，按5%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔2 d取發(fā)酵液8 000 r/min離心，測(cè)試上清液中纖維二糖酶活性。

1.4.2 纖維二糖酶活性測(cè)定方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)液及DNS試劑

1.0 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取1.0 g葡萄糖用蒸餾水溶解定容1 000 ml。纖維二糖酶活性測(cè)定方法采用DNS法[10]，選擇水楊苷作為測(cè)定纖維二糖酶活的底物，1%水楊苷溶液：稱取1.0 g水楊苷分別溶于100 ml的緩沖液中。DNS試劑配制方法如下：

A液：稱取10 g 3,5-二硝基水楊酸和10 g NaOH混合后加水溶解；

B液：稱取200 g 酒石酸鉀鈉溶解于250 ml水中，然后加入2.0 g苯酚，5.0 g Na2SO3，溶解冷卻。A液和B液混合并加蒸餾水定容1 000 ml，存放棕色瓶中7 d后使用。

(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取8支試管分別加入1.0 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 ml，每支試管用蒸餾水分別補(bǔ)足總體積1.5 ml，向每支試管中加入2.0 ml DNS溶液，煮沸10 min，冷卻后加蒸餾水定容至10 ml，測(cè)量OD 540 nm吸光值，以葡萄糖的實(shí)際質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)纖維二糖酶活性的測(cè)定(cellobiase activity)

參考張玉千、彭利沙等報(bào)道方法[11, 12]，向試管中加入1.0 ml 1%的水楊苷溶液和0.5 ml稀釋后的酶液，水浴充分反應(yīng)30 min，加入2.0 ml DNS試劑，加6.5 ml蒸餾水定容至10 ml，OD540 nm測(cè)定吸光度值。酶活力單位(U)定義：在50 ℃、pH 6.0條件下，1 min內(nèi)催化水楊苷生成1 μg葡萄糖所需的酶量。

1.4.3 纖維二糖酶活性菌株形態(tài)特征觀察

通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)板制備1.0×106個(gè)/ml的孢子懸液，取2 μl孢子懸液接種到PDA培養(yǎng)平板中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，觀察菌株的生長(zhǎng)特征。用無菌牙簽在平板上挑取少量的菌絲體放到載玻片上，滴加1滴乳酸酚棉藍(lán)染色液，蓋上蓋玻片，進(jìn)行染色固定，利用生物顯微鏡(目鏡10×，物鏡20×)觀察菌絲體的微觀形態(tài)特征。

1.4.4 18S rDNA基因的擴(kuò)增

利用真菌基因組提取試劑盒提取菌株CB21基因組DNA作為PCR模板，使用引物NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’擴(kuò)增其18S rDNA序列。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后與pTOPO-Blunt Vector載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆菌株送交北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

將測(cè)序得到的18S rDNA核酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，并進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)在線比對(duì)，根據(jù)比對(duì)的結(jié)果從數(shù)據(jù)庫中挑選參考序列，利用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[13]。

2結(jié)果與討論

2.1 篩選纖維二糖酶活性菌株

以纖維二糖作為篩選培養(yǎng)基中的唯一碳源，經(jīng)過平板初篩獲得63株能夠在含有纖維二糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的真菌，將這些菌株轉(zhuǎn)接傳代復(fù)篩，并接種到PDA培養(yǎng)平板上進(jìn)行富集，收集孢子分別接種子瓶和發(fā)酵瓶，分離上清液測(cè)定纖維二糖酶活性。

2.2 酶學(xué)活性分析

目前文獻(xiàn)已報(bào)道檢測(cè)纖維二糖酶(β-葡萄糖苷酶)活性方法有多種，主要包括分光光度法[11]、熒光法[14]、電化學(xué)法[15]等，熒光法和電化學(xué)法雖然靈敏度較高，但實(shí)際操作過程復(fù)雜，主要用于低含量β-葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)。

圖1 菌株CB21和里氏木霉RUT-C30 發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活力比較

國(guó)內(nèi)外纖維二糖酶活性的檢測(cè)常采用分光光度法(pNPG法和水楊苷-DNS法)，主要以對(duì)硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG)和水楊苷為酶解的底物。該研究首先對(duì)分離篩選得到的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，采用水楊苷-DNS法測(cè)定和評(píng)價(jià)發(fā)酵上清粗酶液中纖維二糖酶活性。經(jīng)過多輪復(fù)篩和測(cè)活，發(fā)現(xiàn)編號(hào)CB21的菌株粗酶液中纖維二糖酶活性較高，其酶活力最高達(dá)到342.5 U/ml，在相同的培養(yǎng)發(fā)酵和檢測(cè)條件下，菌株CB21纖維二糖酶活力是工業(yè)菌株里氏木霉RUT-C30的11.3倍，結(jié)果如圖1所示。

將菌株CB21發(fā)酵培養(yǎng)6 d，將發(fā)酵上清粗酶液和水楊苷底物混合，分別在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃保溫反應(yīng)30 min，如圖2(a)所示，在50 ℃～80 ℃寬溫度范圍內(nèi)該菌株纖維二糖酶仍表現(xiàn)出較高的酶活力(80%以上)，其中60 ℃時(shí)該酶的催化活力最高。在不同的pH緩沖液(pH 3～10)中進(jìn)一步測(cè)定該菌株纖維二糖酶的活力，結(jié)果如圖2(b)所示，在pH 6～9范圍內(nèi)上清液中纖維二糖酶活力能夠保持在60%以上，其中中性pH 7條件為該酶的最適反應(yīng)pH。該菌株纖維二糖酶在耐高溫和寬溫度范圍下以及中性pH的反應(yīng)環(huán)境中保持良好的活性，這拓展了其在工業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值。

圖2 菌株CB21纖維二糖酶催化反應(yīng)最適環(huán)境

2.3 高纖維二糖酶活性菌株的形態(tài)學(xué)特征

如圖3(a)所示，在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，CB21的菌落直徑生長(zhǎng)的尺寸約21±2 mm，整個(gè)菌落表現(xiàn)較厚且致密，菌體四周邊緣較為平坦，由中心向外呈現(xiàn)放射褶皺狀，菌體中心部分有明顯的凸起和凹陷，生長(zhǎng)早期平板菌絲體呈白色，成熟后菌體正面呈現(xiàn)艾綠色或灰綠色，表面覆蓋濃密不均的絨狀白色細(xì)小菌絲，成熟的孢子飽滿且呈現(xiàn)綠色，不易脫落。如圖3(b)所示，培養(yǎng)平板背面菌體呈現(xiàn)均勻橘黃色。

圖3 菌株CB21菌落正面和反面的宏觀形態(tài)特征

用無菌牙簽從PDA培養(yǎng)平板上挑取少量CB21菌絲體于載玻片上，為了便于觀察，培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)孢子容易脫落，3～5 d為宜，滴加乳酸酚棉藍(lán)染色液固定。菌絲體的鏡檢顯微特征如圖4所示，CB21菌株的菌絲細(xì)長(zhǎng)，在菌絲的頂端一般產(chǎn)生2～3個(gè)分支，分枝頂端衍生小梗，小梗上串生清晰可見的分生孢子，這些特征符合青霉真菌的特征。

圖4 菌株CB21菌絲體的顯微特征

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

通過PCR擴(kuò)增菌株CB21的18S rDNA基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果如圖5顯示，獲得大小約1 800 bp的預(yù)期DNA條帶。經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與pTOPO-Blunt Vector連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落送交第三方公司進(jìn)行測(cè)序，最后將CB21的18S rDNA基因序列提交NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫，獲得該序列Genbank accession No.OM302164。

圖5 18S rDNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

菌株CB21的18S rDNA序列長(zhǎng)度為1 770 bp，上傳NCBI數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行在線BLAST核酸序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果從數(shù)據(jù)庫中選擇已公開發(fā)表的參考序列，利用MEGA軟件(version 11)進(jìn)行多重對(duì)位排列(Multiple alignments)，參考軟件包中程序分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹狀關(guān)系圖，采用NJ鄰位相連法(Neighbor-joining，NJ)做進(jìn)化距離分析，采用自展法(Bootstrap，重復(fù)次數(shù)1 000次)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，經(jīng)過分析比較，CB21與Penicillium citrinum TG2(Genbank No. KC960012)親緣關(guān)系最近(如圖6所示)，同時(shí)結(jié)合上述該菌株宏觀和微觀的形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定CB21為桔青霉種屬。

纖維素降解酶系中的外切葡聚糖和內(nèi)切葡聚糖催化水解纖維素成纖維糊精和纖維二糖等復(fù)雜混合物，其中纖維二糖是纖維素水解反應(yīng)過程的一種反饋抑制劑，減慢纖維素的完全水解，而纖維二糖酶能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為葡萄糖，從而提高纖維素向葡萄糖的總轉(zhuǎn)化率[16]。纖維二糖酶廣泛存在于不同種屬的微生物中，真菌作為纖維素降解酶的主要生產(chǎn)者，在生物技術(shù)應(yīng)用方面受到了廣泛的關(guān)注，文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)纖維二糖酶活性較高的真菌中包括子囊菌和擔(dān)子菌等，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黃孢原毛皮革菌(Phanerochaete chrysosporium)及里氏木霉(Trichoderma reesei)等[17]。黑曲霉一般作為最有效的纖維二糖酶的生產(chǎn)者和來源，具有產(chǎn)量高和活性高等優(yōu)點(diǎn)，但仍然無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求[18]。目前，關(guān)于產(chǎn)生高活性纖維二糖酶的桔青霉菌的報(bào)道較少[19]，該研究篩選的纖維二糖酶活性菌株為研究纖維素的充分降解提供了備選菌種資源。

圖6 菌株CB21與近緣屬種以18S rDNA 序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹狀關(guān)系圖

3結(jié)論

(1)將纖維二糖作為篩選的唯一碳源，經(jīng)初篩、復(fù)篩獲得一株高纖維二糖酶活性的真菌，編號(hào)為CB21，通過形態(tài)學(xué)鑒別和基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，鑒定菌株CB21為桔青霉屬真菌。

(2)在未做培養(yǎng)條件優(yōu)化的前提下，發(fā)現(xiàn)桔青霉菌CB21產(chǎn)生纖維二糖酶的活力是纖維素酶模式菌株里氏木霉RUT-C30的11.3倍，該菌株可作為開發(fā)微生物降解纖維素技術(shù)，提高利用纖維素資源效率的備選研究菌株。

(3)桔青霉CB21發(fā)酵液中纖維二糖酶在高溫環(huán)境范圍內(nèi)(50～80 ℃)能夠保持良好的活力，且催化反應(yīng)的最適pH為中性，增加了其在未來工業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值。