次氯酸熒光探針的研究進(jìn)展*

李澤強(qiáng)，盛家榮

(南寧師范大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 南寧 530100)

0 引言

活性氧物質(zhì)(Reactive Oxygen Species，ROS)是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成,含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。活性氧物質(zhì)包含次氯酸、過氧化氫、超氧化物自由基陰離子、羥基自由基[1-2]?；钚匝跻蜓趸瘜?dǎo)致機(jī)體的生理發(fā)生變化，進(jìn)而產(chǎn)生多種疾病，如神經(jīng)退行性疾病或癌癥等[3]。在生理條件下，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平經(jīng)過精細(xì)調(diào)節(jié)，在正常細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、基因表達(dá)和體內(nèi)平衡過程中充當(dāng)信使。當(dāng)ROS過量時，會引發(fā)許多有害事件：ROS誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，隨后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生物大分子(如核酸，膜脂和細(xì)胞蛋白)被破壞，這些生物分子的氧化損傷會觸發(fā)細(xì)胞凋亡，與衰老，多種疾病，癌癥和神經(jīng)退行性疾病以及糖尿病和炎癥的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。在近年的檢測中，熒光探針作為一種新型的檢測方法受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。在熒光檢測中，通過把化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光信號，進(jìn)而實現(xiàn)了對生物體內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)檢測。

1 HClO

HClO是一種特殊的活性氧，在抵抗病原體入侵和維持細(xì)胞氧化還原平衡等生理過程中發(fā)揮著重要作用。HClO是一種強(qiáng)氧化劑,能殺死水里的病菌，一般可作為漂白劑或消毒劑用于家庭清潔、飲用水和游泳池中[5]。一般來說，HClO由過氧化氫和氯離子在過氧化酶的催化下反應(yīng)生成，HClO的酸度系數(shù)為7.46，在pH=7.4生理條件下，HClO處在平衡的狀態(tài)。在人體內(nèi)，HClO通過中性粒細(xì)胞中的髓過氧化物酶過氧化氫和氯離子的系統(tǒng)產(chǎn)生。一旦病原體和細(xì)菌侵入人體內(nèi)，HClO作為人體內(nèi)免疫防御系統(tǒng)中的一部分就能夠?qū)ζ浒l(fā)動攻擊，在生理和病理過程中起著非常重要的作用[6]。另外，HClO還能夠與生物中的DNA、脂肪酸、蛋白質(zhì)、膽固醇等多個生物分子發(fā)生反應(yīng)[7]。盡管HClO能夠保護(hù)機(jī)體健康，但是一旦生物體內(nèi)的HClO含量過高或分布異常，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列的疾病，比如說腎臟疾病、神經(jīng)退行性病變等等[8]。

2 熒光探針

活性物質(zhì)對生物體內(nèi)的物質(zhì)正常運(yùn)轉(zhuǎn)與循環(huán)致關(guān)重要。在活性物質(zhì)濃度平衡且正常的狀態(tài)下，能夠?qū)ι矬w內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生積極的影響，但活性物質(zhì)的含量出現(xiàn)異常，將會導(dǎo)致生物體內(nèi)的平衡受到破壞，發(fā)生生理紊亂，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的生理疾病。

熒光探針主要是指某些化合物可以與待檢測物發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而使熒光發(fā)生變化來確定待測物質(zhì)。熒光探針法在生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用已較為成熟，是生物體內(nèi)活性物質(zhì)檢測的重要手段。在熒光探針能將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為光信號。熒光探針法比臨床醫(yī)學(xué)上的生物體內(nèi)活性物質(zhì)檢測的液相色譜法、質(zhì)譜法[9]有更高的檢出率，并且選擇性和生物相容性更好[10]。因此,近些年來，采用熒光探針法檢測活性物質(zhì)成為生物體檢測的主要手段，也是該領(lǐng)域的研究主方向。

2.1 熒光探針的識別

熒光探針的設(shè)計所采用的機(jī)理主要包含分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移是熒光探針經(jīng)常運(yùn)用的機(jī)理[11]?；诜肿觾?nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制的熒光探針分子分為D-Π-A結(jié)構(gòu)，其中D表示推電子基團(tuán)，富含電子；A是拉電子基團(tuán)，具有吸電子的能力[12]。通過兩者的結(jié)合作為識別基團(tuán)再通過Π鍵的連接得到D-Π-A結(jié)構(gòu)(圖1)，分子內(nèi)的供給能力不同的基團(tuán)即可形成電子推拉效應(yīng)[13]。

圖1 ICT機(jī)理熒光探針結(jié)構(gòu)式

2022年，Yang課題組[14]設(shè)計并合成了一種新型熒光探針(CA-SO2)，通過親核加成反應(yīng)可高效、特異地檢測SO2的衍生物，如圖1所示。其設(shè)計合成的新型熒光探針 (CA-SO2) 具有高選擇性、快速響應(yīng)時間(50秒內(nèi))和低檢測限(LOD = 75 nM)。由于該探針中存在苯并噻唑的衍生基團(tuán)，且C=N之間可形成帶有正電荷的銨鹽，進(jìn)而增強(qiáng)了分子內(nèi)的ICT效應(yīng)，使得熒光增強(qiáng)，發(fā)出橙色的熒光， 而在探針溶液中加入SO2衍生物后，通過發(fā)生親核加成反應(yīng)，引入了HSO3-從而導(dǎo)致ICT效應(yīng)減弱，幾乎無熒光，溶液的顏色也尤橙色變?yōu)闊o色，從而達(dá)到“肉眼”檢測 SO2的目的。

2.1.2 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)是指電子的給體或電子的受體受到光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子的給體與電子受體之間發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移進(jìn)而導(dǎo)致熒光發(fā)生淬滅的過程。基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的熒光探針是由識別基因和熒光團(tuán)通過連接臂連接組成[15]?；诠庹T導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的熒光探針在實際應(yīng)用的過程中，通過識別基因與熒光團(tuán)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)后，探針分子熒光淬滅，在與反應(yīng)物接觸后，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)受到了抑制，熒光也由此恢復(fù)。

2021年，Zhou課題組[16]開發(fā)了一種基于萘酰亞胺可用于靈敏和選擇性地檢測生物硫醇的熒光探針(圖2)。該探針設(shè)計選擇引入3,5-二硝基吡啶-2-基作為生物硫醇識別位點，由于3,5-二硝基吡啶-2-基具有很強(qiáng)的吸電子能力，從而使該探針發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)進(jìn)而使熒光猝滅，再通過引入生物硫醇從而觸發(fā)親核取代，將3,5-二硝基吡啶基團(tuán)切斷，從而抑制了PET的過程，進(jìn)而使得熒光增強(qiáng)，發(fā)出黃色的熒光，以達(dá)到對生物硫醇的檢測與識別。

圖2 基于PET機(jī)理的熒光探針示結(jié)構(gòu)式

2.1.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制設(shè)計的熒光探針一般是將熒光的供體與受體通過化學(xué)鍵進(jìn)行連接的。即在一定的條件下，供體吸收光子后，再通過長距離的偶極-偶極相互作用后，再將能量傳給供體[17]。即在供體向受體進(jìn)行轉(zhuǎn)移的過程中，因受到外界光源的刺激后，以非輻射形式實現(xiàn)了能量的轉(zhuǎn)移(圖2)。此現(xiàn)象即為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。

大學(xué)生在大學(xué)期間學(xué)習(xí)鋼琴時應(yīng)注重自身對于所學(xué)知識的掌握，只有自身掌握到了知識，才能夠?qū)⑦@些知識通過自己的轉(zhuǎn)化與研究運(yùn)用到鋼琴教學(xué)中。首先大學(xué)生應(yīng)在大學(xué)期間努力積累鋼琴知識，并能夠保證這些知識能夠得以實踐，現(xiàn)在越來越多的大學(xué)生都只是自己學(xué)會了但并不能夠?qū)⑦@些知識運(yùn)用到實踐中，也就不能夠很好的運(yùn)用到鋼琴教學(xué)中。因此我認(rèn)為，當(dāng)代大學(xué)生應(yīng)首先注重將自身學(xué)到的鋼琴知識完全掌握，并能夠保證將所掌握知識熟練到可以運(yùn)用到實踐當(dāng)中，再從實踐中吸取經(jīng)驗并做積累，這樣才能夠在鋼琴教學(xué)中將自己所學(xué)知識巧妙地運(yùn)用到鋼琴教學(xué)中。

2021年，Tang課題組[18]設(shè)計并合成了一種基于BODIPY熒光團(tuán)的具有FRET機(jī)制的新型同型二聚體熒光探針D-TMSPB(圖3)。該探針采用兩個相同的具有小Stokes位移的熒光團(tuán)連接而形成一個同型2聚體，并且在兩個相同的熒光團(tuán)之間存在FRET時，它們的熒光發(fā)生猝滅。即一個熒光團(tuán)可以作為另一個熒光團(tuán)的猝滅基團(tuán)。而當(dāng)向探針D-TMSPB溶液中加入硫醇后，可使得探針的二硫鍵斷裂，進(jìn)而產(chǎn)生新的二硫鍵，形成TMSPB，即連接體的破壞使兩個熒光團(tuán)擴(kuò)散分開，繼而導(dǎo)致FRET的終止和熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)。

圖3 基于FRET機(jī)理的熒光探針結(jié)構(gòu)式

2.2 HClO熒光探針的研究

HClO是生物體內(nèi)不可缺少的活性氧(ROS)物質(zhì)之一。近年來，隨著熒光探針技術(shù)的不斷發(fā)展，其操作簡單、靈敏度高以及特異選擇性好等優(yōu)勢在臨床檢測中得到了廣泛的普及和應(yīng)用，并且在體內(nèi)HClO的檢測中取得了較好的應(yīng)用成效。

2.2.1 基于對氨基酚的HClO熒光探針

2019年，Liu課題組[19]開發(fā)了一種新的探針HCA-Green(圖4)。該探針使用4-溴-1,8-萘酰亞胺再結(jié)合對氨基酚，從而產(chǎn)生PET效應(yīng)，熒光微弱。對氨基酚作為識別基團(tuán)，當(dāng)加入HClO后，苯酚基被切去，從而破壞了PET效應(yīng)，生成發(fā)綠色熒光的MNA，使探針表現(xiàn)出顯著的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，MNA作為一種理想的雙光子熒光基團(tuán)，具有較大的Stokes位移和光穩(wěn)定性好的優(yōu)點。該探針實現(xiàn)了對HClO的高特異性和超靈敏的熒光響應(yīng)。從而提高了在單光子和雙光子激發(fā)下，探針對HClO的靈敏度。

圖4 探針HCA-Green檢測HClO結(jié)構(gòu)式

2.2.2 基于硒化物的HClO熒光探針

2020年，Jing課題組[20]設(shè)計了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向性的可逆熒光探針(ER-Se)(圖5)。該探針是基于硒作為識別基團(tuán)，當(dāng)加入HClO后，實現(xiàn)對硒原子的氧化，使得熒光減弱，而當(dāng)加入GSH后，由于GSH強(qiáng)的還原性，故可將其還原為原探針ER-Se從而使熒光再次恢復(fù)。該探針不僅具有可逆能力而且對HClO顯示出高靈敏度和良好的選擇性。此外經(jīng)實驗表明，該探針還具有很強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向性的能力。

圖5 探針ER-Se檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

2.2.3 基于肟化物的HClO熒光探針

2013年，Zeng課題組[21]設(shè)計并合成了一種基于BODIPY的熒光探針(bod-oxime)，如圖6所示。該探針以肟基作為識別位點，引入肟基后，由于C=N異構(gòu)化引起的激發(fā)態(tài)衰減過程，使探針不發(fā)熒光，而當(dāng)加入HClO后，發(fā)生脫肟反應(yīng)，氧化生成醛基，從而恢復(fù)了BODIPY熒光基團(tuán)的綠色熒光。由于該探針結(jié)合有親水性羧基和羥基部分故其具有高度水溶性，而且其對HClO較高的靈敏度和選擇性可用與檢測水介質(zhì)中的HClO和活細(xì)胞成像。

圖6 探針bod-oxime檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

2.2.4 基于雙鍵氧化裂解的HClO熒光探針

2020年，Yin課題組[22]構(gòu)建了一個用甲氧基取代喹啉偶聯(lián)二氰基異氟酮的探針(QI)(圖6、圖7)。該探針采用雙鍵作為HClO的反應(yīng)位點，通過喹啉和甲醇之間的雙重協(xié)同作用使雙鍵穩(wěn)定，其中二氰基和吡啶N為吸電子基團(tuán)，甲氧基為供電子基團(tuán)，甲氧基與吡啶N之間的“推拉”電子效應(yīng)導(dǎo)致C=C鈍化。同時相反的是，另一種C=C雙鍵被二氰基的強(qiáng)電子拉力效應(yīng)所激活。引入HClO后，可使得二氰基雙鍵發(fā)生氧化裂解生成羰基，從而可以實現(xiàn)對HClO的特異性檢測。

圖7 探針QI檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

2.2.5 基于對甲氧基酚的HClO熒光探針

2014年，Yang課題組[23]報道了HKOCl-2系列的新型熒光探針(圖8)。該系列探針以對甲氧基酚為識別位點，探針HKOCl-2由于PET效應(yīng)而基本不發(fā)熒光，當(dāng)引入HClO后，對甲氧基苯酚可氧化為對苯醌類，且正鹵素取代類似物(X=F,Cl)被設(shè)計用來進(jìn)一步阻斷苯醌產(chǎn)物的氧化，從而消除PET效應(yīng)，使得熒光由無色變?yōu)榱辆G色。同時該探針對HClO具有良好的選擇性、敏感性和化學(xué)穩(wěn)定性。

圖8 探針HKOCl-2檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

2.2.6 基于硫族化合物的HClO熒光探針

2021年，Zhou課題組[24]制備了一種新型的基于香豆素的熒光探針 Cou-HClO，用于基于HClO介導(dǎo)的氧化脫保護(hù)機(jī)制檢測HClO(圖9)。此探針是通過香豆素衍生物和巰基乙醇的簡單縮合獲得的。且該探針在沒有HClO的情況下，本身表現(xiàn)出基于香豆素而發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。但與HClO反應(yīng)后，此探針的熒光顯著降低。且此探針表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和靈敏度(檢測限為16 nM)和5s內(nèi)的快速響應(yīng)。該探針不僅可用于對各種細(xì)胞中的外源性HClO進(jìn)行成像，還可以確定炎癥期間巨噬細(xì)胞中HClO的波動水平。2019年，Wang課題組[25]構(gòu)建了一種基于酚噻嗪為母體的新型快速響應(yīng)雙光子熒光探針NS-ClO，可用于對活細(xì)胞、組織和新鮮斑馬魚中的內(nèi)源性HClO進(jìn)行成像。該探針NS-ClO是通過將苯并噻唑引入吩噻嗪中而開發(fā)的(圖10)，其中硫原子作為HClO的識別位點。由于吩噻嗪中的硫原子對HClO具有很強(qiáng)的反應(yīng)性，因而當(dāng)加入HClO后可將吩噻嗪中的硫原子氧化為亞砜，并發(fā)射出綠色的熒光。且苯并噻唑也是一種常見的吸電子基團(tuán)，在氧化和還原條件下都很穩(wěn)定，故進(jìn)一步確保了所構(gòu)建的探針在過量的HClO中的穩(wěn)定性。而且其還具有大的開啟信號(約860次)和大的斯托克斯位移(約90 nm)以及對HClO的良好的選擇性；因而此探針可作為檢測HClO的一個工具。

圖9 探針 Cou-HClO檢測HClO結(jié)構(gòu)式

圖10 探針NS-ClO檢測HClO結(jié)構(gòu)式

2020年，Ma課題組[26]構(gòu)建了一種用于測定HClO的新型網(wǎng)狀靶向和比率熒光探針(圖11)。該探針以4-氨基萘酰亞胺為熒光基團(tuán)，以(2-氨基乙基)硫脲基團(tuán)為特異性識別單元，以對甲苯磺酰胺基團(tuán)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位基團(tuán)。當(dāng)HClO不存在時，探針通過分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)過程從而顯示出綠色熒光。而在HClO存在下，ICT的過程受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致熒光發(fā)生了藍(lán)移變成了淺藍(lán)色。其設(shè)計的比率熒光探針對HClO表現(xiàn)出高靈敏度和選擇性。而且該比率型熒光探針可在很寬的pH范圍內(nèi)工作，熒光強(qiáng)度比對HClO濃度呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)。此外，該探針顯示出優(yōu)異的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向能力，已成功應(yīng)用于PC-12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中HClO的共聚焦成像，幾乎沒有細(xì)胞毒性。從而可用于檢測活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HClO。

圖11 基于硫脲識別位點檢測HClO熒光探針結(jié)構(gòu)式

2.2.7 基于其他識別基團(tuán)的HClO熒光探針

2020年，Chang課題組[27]設(shè)計了一種基于羅丹明為母體的單分子熒光探針(ZED)(圖12)。該探針可以同時檢測細(xì)胞中的半胱氨酸/同型半胱氨酸、次氯酸、線粒體膜電位及線粒體通透性轉(zhuǎn)變。該探針是由NBD、香豆素、咪唑鹽和羅丹明四個部分連接組成，用與感知Cys/Hcy、線粒體狀態(tài)和HClO。對檢測Cys與Hcy因篇幅原因暫不贅述，當(dāng)探針(ZED)直接加入HClO后，可將咪唑鹽與羅丹明連接部分切斷，進(jìn)而生成發(fā)紅色熒光的羅丹明B；而在探針(ZED)加入GSH后，可將NBD與香豆素之間的C-O鍵切斷，而生成中間產(chǎn)物ZED-1,再次引入HClO后，又將咪唑鹽與羅丹明連的接部分切斷，一部分生成以香豆素?zé)晒鈭F(tuán)為主體且發(fā)藍(lán)色熒光的產(chǎn)物ZED-2，而另一部分為發(fā)紅色熒光的羅丹明B，從而實現(xiàn)對HClO快速、有選擇性、高靈敏度的識別。

圖12 探針ZED檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

2020年，Wei課題組[28]成功地開發(fā)出以亞甲基藍(lán)(MB)作為熒光團(tuán)的可活化熒光探針(圖13)。該探針最大的優(yōu)點在于可完全溶于水，而亞甲基藍(lán)MB也是一種很好的光聲(PA)成像試劑，可用與光動力學(xué)治療[29]。在加入HClO后可將羰基切斷，生成發(fā)深藍(lán)色光的亞甲基藍(lán)(MB)，進(jìn)而表現(xiàn)出顯著的近紅外(NIR)發(fā)射和吸收變化，同時具有較高的選擇性和靈敏度，可實現(xiàn)對HClO特異性檢測。

圖13 基于MB為母體探針檢測HClO結(jié)構(gòu)式

2021年，Wang課題組[30]開發(fā)了一種新的基于喹啉的熒光探針(HQ)(圖14)用于檢測和可視化類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型中的HClO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。該探針HQ具有供體-π-受體 (D-π-A) 結(jié)構(gòu)，即該結(jié)構(gòu)是由對羥基苯甲醛(電子供體)與1-乙基-4-甲基碘化喹啉(電子受體)通過 C=C雙鍵連接而成，且發(fā)橙黃色熒光。當(dāng)HClO存在時，帶有羥基苯的探針(HQ)會被氧化為苯醌而導(dǎo)致吸收光譜紅移，進(jìn)而使得熒光發(fā)射強(qiáng)烈猝滅。此探針HQ具有高靈敏度和選擇性、快速響應(yīng)和良好的生物相容性等特點，因而可用作監(jiān)測小鼠模型中HClO介導(dǎo)的RA治療反應(yīng)的工具。

圖14 探針HQ檢測HClO機(jī)理結(jié)構(gòu)式

3 結(jié) 語

熒光探針用于生物體內(nèi)活性氧化物的檢測具有選擇性高、生物相溶性好以及檢測限低優(yōu)點。這技術(shù)已廣泛應(yīng)用于在生物學(xué)和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。近年來，各種基于新設(shè)計理念及新反應(yīng)識別位點的新型HClO探針層出不窮，發(fā)展迅猛。但仍然存在一些亟需解決的關(guān)鍵問題，如靶向效果不夠顯著、靶向精準(zhǔn)度有待提高、探針的使用過程中易受到假陽性信號干擾，在生物體內(nèi)易受其他活性氧分子干擾等，開發(fā)響應(yīng)靈敏度高、速率快、熒光發(fā)射波長位于近紅外區(qū)域且切實能應(yīng)用于深層組織或器官的HClO熒光探針是未來的發(fā)展趨勢。