大蒜辣素前體微丸片的制備及其體內(nèi)評價

陶 娟，蘇艷慧，周 圓，鄭春麗*

（1江蘇護理職業(yè)學院藥學與中藥學院，淮安 223005；2中國藥科大學藥劑系，南京 210009）

由于大蒜辣素在自然狀態(tài)下穩(wěn)定性差，溫度、pH 和溶液環(huán)境等因素都易導致大蒜辣素降解［7］，目前上市的大蒜制劑的主要成分為大蒜粉或大蒜油。通過高溫蒸餾提取得到的大蒜油，僅包含不穩(wěn)定的多硫化物和其他揮發(fā)性硫代烯丙基，并不含有大蒜辣素［8］。新鮮大蒜經(jīng)凍干得到大蒜粉，由大蒜粉制成的大蒜片劑或膠囊等蒜粉制劑的有效成分為蒜氨酸和蒜酶。蒜氨酸是大蒜辣素性質穩(wěn)定的前藥，所以蒜粉制劑產(chǎn)生大蒜辣素的量主要取決于蒜酶的活性。蒜酶的活性受溫度、pH 和輔酶因子5′-磷酸吡哆醛（PLP）等多種因素影響，它在pH 低于3.5 的胃液中立即被破壞［9］，直接口服蒜粉制劑后大蒜辣素的生成量極低。

為獲得較高大蒜辣素轉化率的大蒜制劑，目前通常將蒜粉制劑用腸溶薄膜材料包裹制成大蒜腸溶片。該方法雖然保護了蒜酶在胃中的活性，但體外溶出中大蒜辣素轉化率較低（＜30%），這主要是因為大蒜腸溶片需進入小腸后崩解，導致蒜酶和蒜氨酸接觸不充分［10-11］。此外，還可向大蒜制劑中加入一定量控酸劑用以中和胃酸從而避免蒜酶失活。周圓等［12］制備了大蒜辣素前體包芯片，通過控酸外層克服胃酸的酸性環(huán)境生成大蒜辣素，但該包芯片的制備工藝較復雜難以工業(yè)化生產(chǎn)。本研究提出一種新型含控酸劑的pH 調(diào)節(jié)釋放微丸片，即分別將蒜氨酸、蒜酶和控酸劑制成微丸并壓制成微丸片，該片劑在胃液中迅速崩解，其中控酸微丸可將胃液的pH 調(diào)節(jié)至3.5 以上，從而克服由于胃環(huán)境低pH 引起的蒜酶活性降低。本研究制備了大蒜辣素前體微丸片，并對其溶出速率和體內(nèi)降血脂作用進行了研究。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

蒜氨酸（含量98%）、蒜酶（比活力1 235 U/g）（新疆愛樂欣藥業(yè)有限公司）；微晶纖維素（MCC101）、PlasdoneTM聚維酮（PVP）K29/32（美國國際特品公司）；羧甲基淀粉鈉（CMS-Na，德國JRS公司）；甲醇（HPLC 級，山東禹王化學試劑有限公司）；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）檢測試劑盒（南京建成生物試劑研究所）；檸檬酸鈉（SC-Na，南京化學試劑有限公司）；其余化學藥品均為市售分析純。水通過重蒸餾純化，并預先通過0.22 μm的膜濾器（中國中信濾器有限公司）過濾。

1.2 儀 器

擠出滾圓造粒機、JHQ-100流化床干燥機（中國聯(lián)合藥物研究所）；DM Lp偏光顯微鏡（德國Leica公司）；TDP1.5 型單沖壓片機（上海第一制藥機械廠）；JSM-6360LV 型掃描電鏡（日本電子株式會社）；ZRS-8G 智能溶出儀（天津海益達科技有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.3 動 物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體重（250 ± 20）g，由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供，合格證號：SCXK（蘇）2011-0003。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 微丸的制備與表征

2.1.1 控酸鹽的篩選 以Na2CO3、NaHCO3、Ca（OH）2和SC-Na 為候選控酸組分，將上述控酸鹽中2 種或3 種進行組合，考察不同質量配比控酸鹽組合的控酸能力。將控酸鹽組合過100 目篩5次，混合均勻后將其投入人工胃液150 mL中攪拌溶解，并記錄其將胃液pH調(diào)為5~6時控酸鹽的消耗時間和消耗量。

2.1.2 微丸的制備 3 種微丸的處方（100 g）見表1。稱取處方量原料粉末過100 目篩混勻，加入50 μg/mL PVP 水溶液或水作為黏合劑。通過擠出滾圓造粒機制備微丸，并在流化床干燥機中干燥30 min。將含有蒜氨酸、蒜酶和控酸劑的顆粒干燥溫度分別設為50 ℃、30 ℃和40 ℃。篩選粒徑范圍為380~550 μm的微丸進行壓片。

我國在農(nóng)業(yè)發(fā)展階段，服務農(nóng)業(yè)發(fā)展能力有限，無法讓農(nóng)民享受到更有價值的組織服務，使得農(nóng)村經(jīng)濟合作組織無法將自身價值全面發(fā)揮出來。面對此種情況，我國農(nóng)業(yè)部門就需要積極構建農(nóng)村經(jīng)濟合作組織的競爭機制，在省級行政范圍內(nèi)，積極鼓勵農(nóng)業(yè)合作組織之間的競爭，并打破鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村落之間的地域影響，做好合作，從而讓農(nóng)村經(jīng)濟合作組織發(fā)揮出作用，為農(nóng)業(yè)發(fā)展提供更加高質量的服務。

Table 1 Formulation of antacid pellets,alliin pellets and alliinase pellets

2.1.3 控酸微丸體外抗酸實驗 本研究采用Rossett-Rice 實驗［13］考察控酸微丸的控酸效率和控酸時間。將0.1 mol/L HCl 70 mL 與水30 mL 的混合溶液維持在37 ℃模擬基礎胃酸。在磁力攪拌器上攪拌同時以2.0 mL/min 的速度向其中加入0.1 mol/L HCl，以模擬胃部蠕動和胃酸分泌過程。分別將控酸微丸200，300，400 和500 mg 加入燒杯中同時記錄pH隨時間的變化。

2.1.4 微丸圓整度的測定 使用偏光顯微鏡獲得微丸的圖像，采用Image-ProPlus 6.0圖像處理軟件進行分析，獲得圓整度。

2.2 微丸片的制備

大蒜辣素的轉化率取決于制劑中蒜氨酸與蒜酶的比例。將蒜氨酸微丸/蒜酶微丸按不同的質量比例（2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2）制成微丸片。將包含蒜氨酸微丸100 mg 的微丸與控酸微丸500 mg 和微晶纖維素140 mg 混合均勻，使用單沖壓片機將混合物壓制成片劑。通過溶出度試驗檢測大蒜辣素的轉化率以確定該比例。微丸壓片后，通過掃描電子顯微鏡觀察微丸片的橫截面。

2.3 微丸及微丸片體外溶出實驗

2.3.1 蒜氨酸含量測定 色譜條件：C18反相色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-磷酸緩沖溶液（pH 5.0）（5∶95）；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；檢測波長：205 nm；進樣量：20 μL。采用外標法進行定量，配制50 μg/mL 蒜氨酸標準溶液為外標溶液。

2.3.2 大蒜辣素含量測定 色譜條件：C18反相色譜?。?.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%甲酸（60∶40）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：242 nm；進樣量：20 μL，采用內(nèi)標法進行定量，內(nèi)標為20 μg/mL 羥苯乙酯與溶出樣品按1∶1 比例混合的混合溶液。大蒜辣素轉化率（yn）的計算見公式（1）：

式中：V0為溶出介質的體積，Vw為溶出樣品體積，c為大蒜辣素的濃度，QAlliin是蒜氨酸在片劑中的初始含量，MAllicin和MAlliin分別為大蒜辣素和蒜氨酸的相對分子質量，數(shù)字2 表示需要2 個蒜氨酸分子才能生成1個大蒜辣素分子。

2.3.3 體外溶出實驗 取微丸或微丸片按《中華人民共和國藥典》（2020 版）四部通則0931 第三法測定溶出度，以脫氣水或pH 1.2 的人造胃液150 mL 為溶出介質，轉速為75 r/min，依法操作，分別在5，10，15，20，30，45，60 min 取出溶液3 mL 后通過0.45 μm Millipore 過濾器過濾，并及時補充相同溫度相同體積新鮮配制的溶出介質。采用HPLC 分析樣品中的蒜氨酸和大蒜辣素的濃度。

2.4 大鼠降血脂實驗

選取雄性SD 大鼠24 只，適應環(huán)境5 d 后將大鼠隨機分為對照組（control）和模型組（model）。以正常大鼠飼料飼養(yǎng)對照組，以含有1%膽固醇的高脂飼料飼養(yǎng)模型組。每兩周對大鼠進行眼底取血，將血液與肝素混合并以4 000 r/min離心15 min以獲得血清，根據(jù)試劑盒要求分別檢測血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 含量，總血脂膽固醇高于正常指標20%的為造模成功。1 個月后將造模成功的18 只高脂血癥大鼠隨機分成3 組：模型組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組。由于片劑尺寸較大，大鼠口服給藥較困難，因此采用將微丸裝入膠囊中給藥。對照組和模型組給予僅含有微晶纖維素的空白微丸膠囊；試驗Ⅰ組服用含有蒜氨酸微丸（37 mg/kg）和蒜酶微丸（55.5 mg/kg）的膠囊；試驗Ⅱ組服用含有蒜氨酸微丸（37 mg/kg）、蒜酶微丸（55.5 mg/kg）和控酸微丸（44 mg/kg）的膠囊。連續(xù)給藥2 個月后收集血液。采用SPSS 16.0 軟件對體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

3 結 果

3.1 微丸的制備與表征

3.1.1 控酸鹽的篩選 為了在短時間內(nèi)使胃酸的pH 高于3.5，以保持蒜酶的活性，篩選了幾種不同控酸鹽的組合以及每種組合中控酸鹽的質量配比，最終的篩選結果列于表2。在所有組合中，同時使用NaHCO3和SC-Na可以在最短時間內(nèi)以最少的量將人工胃液的pH 調(diào)節(jié)至所需水平。因此，選擇NaHCO3和SC-Na 作為控酸微丸中的控酸鹽組合。

3.1.2 控酸微丸體外抗酸實驗 Rossett-Rice 試驗結果如圖1 所示。當加入控酸微丸的質量為400 mg 或更高時，可將人工胃液的pH 調(diào)節(jié)到4 以上。加入控酸微丸500 mg 在1 min 內(nèi)可以將人工胃液150 mL 的pH 調(diào)節(jié)至4，并使其pH 5~pH 6 之間維持30 min。

Table 2 Weight proportion of salt combinations and time needed to neutralize 150 mL simulated gastric fluid to pH 5-pH 6

Figure 1 Plots of pH vs time for different amounts of antacid pellets in Rossett-Rice test

3.1.3 微丸圓整度 微丸的圓整度是影響微丸壓片后混合均勻度的關鍵參數(shù)。圓形對象的圓度值等于1。計算對象的圓度值越接近1，表明其圓整度越好。在偏光顯微鏡下觀察到的微丸圖像如圖2 所示。從外觀來看，所有微丸圖像都接近圓形。蒜氨酸微丸的圓度值為1.349，蒜酶微丸為1.134，控酸劑微丸為1.245，均接近1，表明3 種微丸的圓整度良好。

Figure 2 Images of pellets under polarized light microscopy

3.2 控酸微丸片的微觀形態(tài)

圖3 為控酸微丸片橫截面的掃描電鏡照片?？厮嵛⑼栌捎诤匈x形劑的比例較小，與片劑中的其他兩種微丸相比控酸微丸的硬度較低，在壓片過程中被壓碎并散布在其他兩種微丸中，可以發(fā)揮緩沖微丸的作用，避免蒜氨酸與蒜酶微丸直接接觸并保持完整。

Figure 3 SEM micrograph of a cross section of allicin pro-drug tablet containing antacid pellets

3.3 體外溶出實驗

3.3.1 微丸片中蒜氨酸和蒜酶比例的確定 國際上采用潛在大蒜辣素含量（potential content of allicin）為大蒜及其相關品種的檢測指標，潛在大蒜辣素含量為在水中加入大蒜粉或碎蒜片可獲得的最大蒜辣素轉化率［14］。因此在本研究中選擇大蒜辣素轉化率作為溶出度研究中片劑的評價標準。微丸片中含有不同比例蒜氨酸和蒜酶微丸時大蒜辣素的最大轉化率結果如圖4 所示。從結果可以看出，當蒜氨酸微丸和蒜酶微丸比例為2∶1時，大蒜辣素轉化率只有15%，隨著蒜酶比例上升，大蒜辣素轉化率也逐漸升高，當兩者比例達到1∶1.5 時，轉化率可達到90%以上，比例為1∶2 時，大蒜辣素的轉化率不再增加，因此將微丸片中蒜氨酸微丸和蒜酶微丸比例固定在1∶1.5。

Figure 4 Allicin yield on different ratio of alliin pellets to alliinase pellets from tablets in simulated gastric fluid(± s,n = 6)

3.3.2 微丸溶出實驗 圖5為蒜氨酸和蒜酶微丸（1∶1.5）在水和人工胃液中的溶出曲線。在水中，大蒜辣素的轉化率超過90%，蒜氨酸的溶出度極低（圖5-A）。然而，在人工胃液中，由于大部分蒜酶在低pH 條件下被破壞，因此幾乎沒有蒜氨酸被催化形成大蒜辣素。大蒜辣素的轉化率低于5%，蒜氨酸的溶出度高于90%（圖5-B）。

Figure 5 Dissolution and yield profiles of combination of alliin pellets and alliinase pellets (1∶1.5)in water(A)and in artificial gastric fluid(B)(xˉ±s,n = 6)

3.3.3 微丸片溶出實驗 當將不含控酸微丸的微丸片放入人工胃液中時，蒜酶失去活性無法將微丸中的蒜氨酸轉化為大蒜辣素，大蒜辣素的轉化率極低。將含控酸微丸的微丸片放入人工胃液中后，保護了蒜酶的活性，30 min 后大蒜辣素的轉化率上升到90%以上（圖6）。

Figure 6 Yield profiles of allicin in tablets with or without antacid pellets(± s,n = 6)

3.4 體內(nèi)降血脂研究

大鼠高膽固醇飲食飼喂1 個月后，模型組的TC、TG、HDL-C、LDL-C 4項指標水平均顯著高于對照組（P＜0.05），且TC 和TG 指標均上升了20%以上，表明成功建立了大鼠高脂血癥模型。

按給藥方案連續(xù)給藥2 個月后測定4 組大鼠的血清脂質水平，結果如圖7 所示。與對照組相比，由于長期供應高脂飲食，模型組的4 項指標顯示出極顯著差異（P ＜0.01）。與模型組相比，試驗Ⅰ組中的4 項指標幾乎沒有變化。試驗Ⅱ組中的TC、TG 兩項指標均顯著下降，LDL-C 指標有下降、HDL-C 指標變化不大。試驗Ⅱ組的結果與Steiner等［15］的研究一致，即大蒜辣素對高血脂癥中TC 和TG 有明顯療效，而對HDL-C 和LDL-C 效果不顯著。因此，從上述結果中可以看出，含有控酸微丸的試驗Ⅱ組的療效優(yōu)于不含控酸微丸的試驗Ⅰ組。

由于試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組之間的血流動力學基線水平不同，因此可以通過計算給藥后血清脂質水平的變化反映出兩種微丸組合對高脂血癥大鼠的影響。如圖8 所示，試驗Ⅰ組中4 個指標的變化小于10%。但是，試驗Ⅱ組中的最大變化率增加到46%（TG），并且所有血清脂質水平都恢復到或稍高于建模前的水平?？梢杂^察到兩個試驗組之間存在顯著差異（P＜0.05）。這些結果表明，控酸微丸能避免大鼠胃中胃酸對蒜酶活性的影響，生成更多的大蒜辣素?？厮嵛⑼枘軐⒋笫蟮奈杆醦H調(diào)節(jié)至適當水平，提高大蒜辣素的轉化率，對高脂血癥的治療顯示出積極的治療效果。

Figure 7 Serum lipid levels in each group of rats after drug administration for two months (± s,n = 6)

Figure 8 Changes of serum lipid levels in group I and group II after drug administration(± s,n = 6)

4 結 論

本研究將蒜氨酸和蒜酶微丸與控酸微丸混合并壓片制成大蒜辣素前體微丸片，體外溶出實驗結果表明在微丸片中加入控酸微丸能夠調(diào)節(jié)人工胃液環(huán)境滿足蒜酶催化活性的pH，從而保護蒜酶在人工胃液中的活性、提高大蒜辣素轉化率至90%以上。大鼠體內(nèi)降血脂研究結果證明，控酸微丸保護了蒜酶在大鼠體內(nèi)的活性，產(chǎn)生較高轉化率的大蒜辣素，從而使含控酸微丸的微丸片與不含控酸微丸的片劑相比具有較好的降血脂作用，為大蒜辣素臨床應用提供了一種高轉化率且易于產(chǎn)業(yè)化的制劑方法。