立枯絲核菌拮抗青霉菌發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

安婧婧 沈瑞清

摘要 研究立枯絲核菌拮抗青霉菌繩狀青霉和草酸青霉發(fā)酵液穩(wěn)定性，為今后生防青霉菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。采用牛津杯法測定立枯絲核菌拮抗青霉菌繩狀青霉、草酸青霉發(fā)酵液對于溫度和酸堿度的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，繩狀青霉菌株發(fā)酵液在20 ℃、處理10 min和pH=3、處理2 h的情況下，抑菌活性最高，而當(dāng)溫度超過50 ℃，中性條件會抑制繩狀青霉菌株的抑菌活性;草酸青霉菌株發(fā)酵液在40 ℃、處理10 min和pH=9、處理2 h的情況下抑菌活性最高，而當(dāng)溫度超過60 ℃，中性條件或過堿性條件會抑制該菌株的抑菌活性。

關(guān)鍵詞 拮抗菌;發(fā)酵液;穩(wěn)定性;牛津杯法

中圖分類號 S 432.4 +4? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）08-0129-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Stability of Fermentation Penicillium Produced by Antagonistic Strain against Rhizoctonia solani

AN Jing-jing 1，SHEN Rui-qing 2 （1.Agricultural，Rural and Water Bureau of Xingqing，Yinchuan，Ningxia 750001;2.Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750001）

Abstract To explore the stability of fermentation Penicillium funiculosum produced by antagonistic strain against Rhizoctonia solani，which could provide theory basis for the future development of Rhizoctonia solani biocontrol agents. This study tested the temperature stability，acid and alkali stability of fermentation Penicillium funiculosum and Penicillium oxalicum produced by antagonistic strain against Rhizoctonia SolaniIn by Oxford cup method.The study showed that Penicillium funiculosum had the highest antibacterial activity while 20 ℃，10 min and pH=3，2 h，but when the temperature was higher than 50 ℃，and neutral conditions would? inhibit the antibacterial activity of? its strain，and Penicillium oxalicum had the highest antibacterial activity while 40 ℃，10 min and pH=9，2 h，but when the temperature was higher than 60 ℃，and neutral conditions and more alkaline conditions would inhibit the antibacterial activity of? its strain.

Key words Antagonistic bacteria;Fermentation broth;Stability;Oxford cup method

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani） 分布廣泛，適應(yīng)能力強(qiáng)，生長速度快，由它引起的立枯病在全國各地均有不同程度的發(fā)生，尤其在育苗中后期發(fā)病嚴(yán)重，常造成大量死苗甚至毀床 [1-2]。近年寧夏區(qū)內(nèi)有許多馬鈴薯種植區(qū)無法倒茬，致使土壤中病原菌數(shù)量逐年增加，因此加重了黑痣病的發(fā)生并帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失 [3]。目前對于病原真菌的控制方法主要有加強(qiáng)田間管理、培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑等。但在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)這些方法都很難達(dá)到防治效果，因此采用生防制劑防治病原微生物受到越來越多的重視，且已經(jīng)成為防治植物病害的重要途徑。生防制劑在實(shí)際應(yīng)用過程中，容易受到自身穩(wěn)定性的影響，同時其生物活性物質(zhì)能否有效地發(fā)揮作用也與自身的穩(wěn)定性有密切關(guān)系 [4-6]。即使篩選得到了抑菌效果良好的菌株，也可能因生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性差而無法在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用，因此對拮抗生防菌抑菌活性穩(wěn)定性探究十分必要。筆者對立枯絲核菌拮抗青霉菌發(fā)酵液穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為生防菌的開發(fā)和抑菌活性物質(zhì)的分離純化提供理論依據(jù) [6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 立枯絲核菌。立枯絲核菌來自寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理實(shí)驗(yàn)室，分離自立枯絲核菌侵染的馬鈴薯病薯。

1.1.2 青霉菌。毒霉菌分離自土壤中。

1.1.3 培養(yǎng)基。發(fā)酵所用的培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基;對峙所用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基 [9]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗青霉菌菌株發(fā)酵液的制備。

將接于PDA平板上經(jīng)活化的繩狀青霉菌和草酸青霉菌用直徑5 mm的打菌器打成菌餅，接于50 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床上振

蕩3 d，將發(fā)酵液在高速離心機(jī)800 r/min下離心15 min，后用微孔濾膜過濾，得到青霉菌菌株的無菌發(fā)酵液 [10-11]。

1.2.2 菌株發(fā)酵液對溫度的穩(wěn)定性。

將菌株的濃縮發(fā)酵液分別在20、30、40、50、60 ℃條件下處理10、20、30 min后，吸取5 μL濃縮發(fā)酵液，用牛津杯法做與立枯絲核菌的對峙試驗(yàn)，每個溫度梯度重復(fù)3次，根據(jù)其生長情況測定發(fā)酵液對溫度的穩(wěn)定性。

1.2.3 菌株發(fā)酵液對pH的穩(wěn)定性。分別配制1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH，用該酸和堿將無菌發(fā)酵液的pH分別調(diào)至3、5、7、9、11后，分別放置1、2、3 h，再將發(fā)酵液調(diào)回到原始酸堿度，吸取濃縮發(fā)酵液5 μL，用牛津杯法做與禾谷鐮刀菌的對峙試驗(yàn)，每個梯度重復(fù)3次，根據(jù)菌株生長情況測定發(fā)酵液對酸堿的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 繩狀青霉菌株對溫度和pH的穩(wěn)定性 繩狀青霉菌株無菌發(fā)酵液在試驗(yàn)各溫度梯度處理不同時間后與立枯絲核菌做對峙培養(yǎng)的生長情況見表1。從表1可以看出，在所有溫度梯度的不同時間處理下，拮抗活性最好的處理是20 ℃、10 min，在20～40 ℃的處理溫度下，其拮抗活性的變化沒有明顯規(guī)律，當(dāng)溫度升高到50 ℃時，菌株發(fā)酵液的拮抗活性隨溫度的升高和處理時間的增長而呈下降趨勢，即當(dāng)溫度升高到50 ℃，菌株發(fā)酵液的抑菌活性開始下降，且隨著處理時間的增長，下降幅度越大，但當(dāng)溫度升高到60 ℃時，則抑制了菌株發(fā)酵液的生長。由此可知，立枯絲核菌拮抗繩狀青霉的抑菌活性物質(zhì)在40 ℃以下具有相對穩(wěn)定性，對高溫不具有耐受力。

繩狀青霉菌株發(fā)酵液在不同pH下處理不同時間后與立枯絲核菌做對峙試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，在所有處理中，pH=3、處理2 h時菌株發(fā)酵液具有最高活性，其生長勢最好，對立枯絲核菌的抑制效果最強(qiáng)，pH=9、處理1 h抑制效果次之。而抑菌活性最弱的處理是pH=7、處理2 h，表現(xiàn)為生長勢最弱。其他不同pH下的處理之間和相同pH不同時間的處理之間均無顯著差異。由此可知，立枯絲核菌拮抗繩狀青霉菌菌株的抑菌物質(zhì)在酸性和堿性條件下均能發(fā)生抑菌作用，而在中性條件下抑菌活性最低，即中性條件會抑制該菌株發(fā)酵液的抑菌活性。

2.2 草酸青霉菌株對溫度和pH的穩(wěn)定性 草酸青霉菌株無菌發(fā)酵液在試驗(yàn)各溫度梯度下處理不同時間后與立枯絲核菌對峙培養(yǎng)的生長情況見表3。由表3可知，在40 ℃、10 min的處理下，該菌株發(fā)酵液的生長情況最好，與未經(jīng)處理的對照組最為接近。20 ℃、20 min的處理和60 ℃、10 min的處理次之，生長情況最差的是50 ℃、30 min的處理，而當(dāng)60 ℃處理20 min以上則完全抑制菌株發(fā)酵液的生長，其他處理之間差異不大。單看各溫度的組內(nèi)處理之間的生長情況，發(fā)現(xiàn)除20 ℃外，其他溫度組內(nèi)處理之間都是10 min處理下的生長情況優(yōu)于20、30 min處理下的生長情況。由此可知，立枯絲核菌生防青霉菌草酸青霉菌株發(fā)酵液在40 ℃、處理10 min時具有最高活性，對高溫不具有耐受力且處理時間不宜過長。

草酸青霉菌株發(fā)酵液在不同pH下處理不同時間后與立枯絲核菌做對峙試驗(yàn)的生長情況見表4。由表4可知，在pH=9、處理2 h時，該菌株發(fā)酵液具有最高抑菌活性，pH=5、處理1 h時抑菌活性次之，而在pH=11、處理3 h時抑菌活性最低，表現(xiàn)為生長狀況最差。從整體看，抑菌情況最差的是pH為7和11時，由此可以推斷，該立枯絲核菌拮抗青霉菌草酸青霉菌株發(fā)酵液在中性條件和偏堿性條件下抑菌效果較差，即這2種條件會抑制該菌株發(fā)酵液的抑菌活性。

3 結(jié)論與討論

生物防治是克服化學(xué)農(nóng)藥負(fù)效應(yīng)的一條有效途徑 [6]，篩選生防菌、生防制劑等對于防治立枯絲核菌病具有十分重要的意義。該試驗(yàn)從土壤中篩選得到2株對立枯絲核菌拮抗作用較好的生防青霉菌，探究了溫度和pH對其抑菌活性的影響，結(jié)果表明，繩狀青霉菌菌株發(fā)酵液在溫度20 ℃、處理10 min和pH=3、處理2 h時，抑菌效果達(dá)到最好，對中性條件和高溫不具有耐受力。草酸青霉菌株發(fā)酵液在40 ℃、處理10 min和pH=9、處理2 h的情況下抑菌活性最高，對高溫、中性或過堿性條件不具有耐受力。

該研究結(jié)果表明，這2株拮抗青霉菌均具有相對穩(wěn)定的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，因此具有可開發(fā)成生防制劑的潛能。當(dāng)然溫度和pH也只是影響抑菌活性的部分因素，還有其他影響因子，如紫外光照射、無菌發(fā)酵液的培養(yǎng)條件 [12]等，都需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，此外，還需要進(jìn)行田間防病試驗(yàn)，進(jìn)一步檢驗(yàn)其防效的穩(wěn)定性，以便應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，更好地發(fā)揮其生防作用。

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