西藏牦牛腸出血性大腸桿菌HPI基因調(diào)查及耐藥性分析

盧姊豪 貢嘎 常攀 武琦 李天驕 吳丹 羅潤波 索朗斯珠

摘要：為明確西藏牦牛源腸出血大腸桿菌強毒力島（HPI）基因以及ESBLs耐藥基因攜帶情況，復(fù)壯筆者所在實驗室保存的14株牦牛源腸出血性大腸桿菌，采用麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基進行篩選，鏡檢確定復(fù)壯成功后，應(yīng)用PCR方法檢測HPI攜帶情況，并對HPI相關(guān)毒力基因進行克隆與序列分析，測序結(jié)果同時采用K-B紙片法對被檢菌株進行藥敏試驗和ESBLs表型檢測，最后應(yīng)用PCR方法進行ESBLs耐藥基因檢測。結(jié)果顯示，14株被檢菌株中HPI標志性基因 fyuA 的攜帶率最高，達42.86%（6/14），其次分別為ybtA、irp2和irp8基因，攜帶率均為21.43%（3/14），irp3攜帶率為14.2%（2/14），而未檢測到irp5陽性基因。分離菌株對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、阿米卡星的耐藥率均≥57.14%，對派拉西林、羧芐西林、頭孢他啶、環(huán)丙沙星耐藥率均 ≥21.43%，并存在多種耐藥現(xiàn)象，耐藥譜集中在3～10耐，其中6耐菌株最多，有5株，其次為8耐3株、7耐2株，10耐、9耐、5耐和3耐均1株。對被檢菌株進行14種ESBLs類基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢菌株只攜帶1種ESBLs類基因，為 bla? TEM基因，攜帶率21.43%（3/14）。綜上，西藏牦牛源腸出血性大腸桿菌中存在HPI基因。對常用抗菌藥產(chǎn)生較高的耐藥性并存在多種耐藥現(xiàn)象，但對ESBLs類藥物具有較高的敏感性。

關(guān)鍵詞：腸出血性大腸桿菌;強毒力島;耐藥性;西藏牦牛

中圖分類號： S855.1+2? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0051-08

收稿日期：2021-07-04

基金項目：國家肉牛/牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-37）;西藏自治區(qū)科技廳2019年度重點項目（編號：201901）。

作者簡介：盧姊豪（1998—），女，北京人，碩士研究生，主要從事高原動物傳染病研究，E-mail：670630168@qq.com;共同第一作者：貢 嘎（1983—），男，西藏拉薩人，博士研究生，主要從事高原動物傳染病研究，E-mail：xzlzgg@163.com。

通信作者：索朗斯珠，博士，教授，主要從事高原動物傳染病研究。E-mail：xzslsz@163.com。

目前，出血性大腸桿菌（enterohaemorrhagic ?Escherichia coli ，EHEC）是6種大腸桿菌中重要的食源性病原菌，給食品健康帶來前所未有的挑戰(zhàn)。牛源EHEC是引起人類大腸桿菌病的主要來源之一。據(jù)報道，國外健康牛以及牛肉中分離出EHEC（O46血清型）并給人類健康帶來一定的危害[1-2]。趙燕娟等2019年從西藏牦牛體內(nèi)分離鑒定出牦牛源腸出血性大腸桿菌并確定主要毒力基因為 ehxA [3]，提示西藏牦牛群中確實存在腸出血性大腸桿菌。

強毒力島（high pathogeniticity island，HPI）也稱為耶爾森菌強毒力島。它的核心基因主要有6種，分別為fyuA、irp2、irp8、irp5、ybtA和irp3組成，其中irp2和fyuA是HPI基因簇的核心基因[4]。耶爾森菌強毒力島在大腸桿菌和耶爾森菌之間進行水平傳播的相關(guān)報道很多，并與致病性大腸桿菌的毒力有關(guān)系[5]。Schubert等早在1997年就從大腸桿菌中檢測到irp2和fyuA。但目前西藏牦牛腸出血性大腸桿菌HPI基因檢測鮮有報道。

大腸桿菌引起的腹瀉病是西藏牦牛的主要疾病之一，但由于抗菌藥物的不合理使用，造成牦牛大腸桿菌耐藥現(xiàn)象不斷增多，給牦牛大腸桿菌病的防治帶來嚴峻挑戰(zhàn)。貢嘎等2014年報道西藏牦牛大腸桿菌耐藥率較高且存在多重耐藥現(xiàn)象[6]，2020年王剛等報道西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的ESBLs陽性率為55.3%，說明西藏牦牛大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象較為嚴重[7]。但目前未見檢測西藏牦牛腸出血性大腸桿菌耐藥性以及碳青霉烯類藥物耐藥性的相關(guān)報道。因此，本研究對筆者所在實驗室保存的14株牦牛源腸出血性大腸桿菌進行首次HPI標志基因檢測、耐藥性檢測及碳青酶烯類藥物耐藥性檢測以明確西藏牦牛源腸出血大腸桿菌HPI基因及ESBLs耐藥基因攜帶情況。

1 材料與方法

1.1 材料

14株牦牛源腸出血性大腸桿菌株由筆者所在實驗室于2019年鑒定保存。其中，西藏阿里8株、日喀則3株、林芝2株、昌都1株，按以上順序分別命名為TBY1、TBY2、TBY3、TBY3、TBY4、TBY5、TBY6、TBY7、TBY8、TBY9、TBY10、TBY11、TBY12、TBY13、TBY14[4]。

1.2 主要試劑

大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基由筆者所在實驗室自制[8];常用抗菌藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。Green Taq Mix、PCR試劑、核酸染料Gel View等購自豐科生物科技有限公司（昆明）。

1.3 細菌復(fù)蘇培養(yǎng)及鑒定

待復(fù)蘇的菌株接種在普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，在37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察培養(yǎng)特性，同時進行細菌革蘭氏染色鏡檢觀察。普通肉湯上生長的菌液劃線接種至瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)18 h后挑取單個菌落接種至麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍平板上，37 ℃培養(yǎng)，觀察。

1.4 HPI相關(guān)基因PCR檢測

提取細菌基因組DNA，根據(jù)文獻[9]中報道的HPI基因引物進行PCR鑒定，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：Green ?Taq ?Mix 25 μL，上游及下游引物各2 μL，模板 DNA 4 μL、dd H 2O 17 μL，50 μL體系。PCR擴增反應(yīng)為：94 ℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，退火溫度見表1，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。最后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。

1.5 藥敏試驗、ESBLs表型及ESBLs耐藥基因檢測

取成功復(fù)蘇的菌液涂布接種至普通瓊脂上，將臨床常用17種抗生素藥敏紙片和1種碳青霉烯類（亞胺培南）紙片貼于瓊脂平板表面中央，倒置平皿，放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。抑菌結(jié)果參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）2013年公布的標準作出判定，具體見表2。

提取細菌基因組DNA，根據(jù)文獻[9]中報道的ESBLs類基因引物進行PCR鑒定，引物序列見表3。PCR反應(yīng)體系和程序見“1.4”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株復(fù)壯結(jié)果

由圖1可知，被檢菌株在伊紅美藍上生長為黑色帶金屬光澤的濕潤圓形菌落，在麥康凱上生長邊緣整齊、表面光滑的典型紅色菌落，革蘭氏染色染結(jié)果為兩端略圓的紅色短桿菌。

2.2 ?fyuA 基因攜帶情況及進化分析

通過PCR檢測、測序并在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)被檢14株菌株中有6株與GenBank上 fyuA 基因同源性98%以上，確定為 fyuA 基因陽性，陽性率最高，達42.86%（6/14），分別為TBY3～TBY8，均來自西藏阿里;TBY10和TBY11，來自西藏日喀則。系統(tǒng)進化分析（圖2、圖3）顯示，6株菌株與韓國人源CP026473和巴西人源CP0196的 fyuA 基因聚成一簇，親緣關(guān)系較近。

2.3 irp2基因攜帶情況及進化分析

通過PCR檢測、測序并在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)被檢的14株菌株中有3株與GenBank上irp2基因同源性99%以上，確定為irp2基因陽性，陽性率最高，達21.43%（3/14），分別為TBY7來自西藏阿里，TBY10和TBY11來自西藏日喀則。系統(tǒng)進化分析（圖4、圖5）顯示，3株菌株單獨聚成一個小簇，與荷蘭人源CP068990、美國雞源CP056077、中國合肥鴨源CP045206及日本人源AP02411的irp2基因聚成一個大簇，親緣關(guān)系相對較近。

2.4 irp3基因攜帶情況及進化分析

通過PCR檢測、測序并在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)被檢的14株菌株中有2株與GenBank上irp3基因同源性98%以上，確定為irp3基因陽性，陽性率最高，達14.29%（2/14），分別為TBY7來自西藏阿里，TBY10來自西藏日喀則。系統(tǒng)進化分析（圖6、圖7）顯示，2株菌株與美國人源CP054379CP003034的irp3基因聚成一簇，親緣關(guān)系相對較近，而其他物種雞源、旱瀨源、鴨源等irp3的基因親緣性較遠。

2.5 irp8基因攜帶情況及進化分析

通過PCR檢測、測序并在NCBI上進行比對，發(fā)現(xiàn)被檢的14株菌株中有3株與GenBank上irp8基因同源性98%以上，確定為irp8基因陽性，陽性率最高，達21.43%（3/14），分別為TBY7來自西藏阿里，TBY10和TBY11來自西藏日喀則。系統(tǒng)進化分析（圖8、圖9）顯示，3株菌株與美國人源CP054353和中國杭州人源CP04101的irp8基因親緣關(guān)系相對較近。

2.6 ?ybtA 基因攜帶情況及進化分析

通過PCR檢測、測序并在NCBI進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被檢的14株菌株中有3株與GenBank上 ybtA 基因同源性98%以上，確定為 ybtA 基因陽性，陽性率最高，達21.43%（3/14），分別為TBY7來自西藏阿里，TBY10和TBY11來自西藏日喀則。系統(tǒng)進化分析（圖10、圖11）顯示，3株菌株與澳大利亞智人源CP058574的 ybtA 基因親緣關(guān)系相對較近。

2.7 耐藥表型結(jié)果

由藥敏試驗結(jié)果（表4）可知，本研究對牦牛源腸出血性大腸桿菌進行7類18種抗菌藥物耐藥表型檢測，結(jié)果耐藥率達到50%以上的有7種藥物，耐藥最嚴重的是青霉素（100%），其次是頭孢唑林、頭孢氨芐、苯唑西林、阿米卡星、頭孢拉定和氨芐西林，耐藥率分別為92.86%、85.71%、71.43%、71.43%、5714%和57.14%。并且存在多重耐藥現(xiàn)象，其中，6耐5株、8耐3株、7耐2株，10耐、9耐、5耐和3耐均為1株。14株被檢菌株對碳青霉素烯類（亞胺培南）、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮、多黏菌素B和頭孢西丁等7種藥物敏感率100%。

2.8 ESBLs基因檢測結(jié)果

對14株牦牛源腸出血性大腸桿菌進行14種ESBLs類基因的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢菌株只攜帶1種ESBLs類基因，為 bla? TEM基因，攜帶率21.43%（3/14）。PCR擴增電泳圖見圖12、圖13。

3 討論

致病性大腸桿菌毒力的強弱與從宿主攝取鐵的能力直接相關(guān)。強毒力島（HPI）基因是致病性大腸桿菌的重要毒力因子，具有保守的核心區(qū)域，致病性大腸桿菌在宿主體內(nèi)獲得這些毒力因子并生存在宿主體內(nèi)，最終導(dǎo)致宿主發(fā)病。此外，這些毒力因子可在人和動物間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，因此，存在一定的公共衛(wèi)生安全問題。

耶爾森菌強毒力島是牛源、兔源、人源致瀉性大腸桿菌的重要毒力因子[10-13]，但有關(guān)西藏地區(qū)牦牛源大腸桿菌HPI毒力島的檢測尚未見報道。本研究復(fù)蘇筆者所在實驗室保存的牦牛源腸出血大腸桿菌14株，通過PCR方法檢測其強毒力島基因fyuA、irp2、irp3、irp8，ybtA、irp5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14株牦牛源腸出血性大腸桿菌中檢出5種HPI基因，分別為 fyu A、 irp 2、 irp 3、 irp 8和 ybt A，檢出率分別為4286%（6/14）、21.43%（3/14）、14.2%（2/14）、21.43%（3/14）和21.43%（3/14），其中 fyuA 基因檢出率最高。

fyuA和irp2基因是HPI基因簇的主要結(jié)構(gòu)基因之一，編碼產(chǎn)物對于細菌在低鐵環(huán)境下的生存具有重要的意義。本研究中 fyuA 基因攜帶率最高，為42.86%（6/14），遠低于高海慧等報道的寧夏犢牛大腸桿菌的陽性率82.67%（62/75）[8]、朱利霞等報道的河北肉牛溶血性大腸埃希菌的陽性率957%（22/23）[13]和元振杰等報道的新疆致犢牛腹瀉大腸桿菌的陽性率91.67%（11/12）[14]，而高于王姣姣等報道的吉林省犢牛腹瀉大腸桿菌的檢出率30%（10/33）[15]和徐繼英等報道的中國北京等7個省份奶牛乳腺炎源大腸桿菌的陽性率18.94%（36/190）[16]。與不同種動物（豬源、禽源）相比，本次結(jié)果與云南撒壩豬源大腸桿菌的檢測率43.18%（19/44）[17]基本相一致，遼寧錦州地區(qū)雞大腸桿菌的檢測率18.7%（28/150）[18]明顯低于本次結(jié)果。不同地域、不同品種的動物之間 fyuA 基因檢出率的差異原因有待進一步研究。有研究表明，irp2基因僅在強致病性大腸桿菌中才能存在，本研究中被檢的14株菌株中irp2基因的檢出率為21.43%（3/14）[19]。此外，14株被檢菌株對6種毒力基因組合模式進行分析發(fā)現(xiàn)，攜帶5種基因的菌株3株，分別為TBY7、TBY10和TBY11，毒力基因組合模式為：irp2+irp3+irp8+fyuA+ybtA，占陽性菌株的3571%。與孫武文研究的攜帶5種基因的模式[20]一致，這是否成為牛種動物致病性大腸桿菌的HPI毒力基因的組合模式需要更多數(shù)據(jù)的支撐。

新德里金屬 β -內(nèi)酰胺酶（NDM）能夠水解所有金屬內(nèi)酰胺酶（除單環(huán) β -內(nèi)酰胺酶類外）[22-23]，在革蘭氏陰性細菌臨床治療中碳青霉烯酶是最后一道防線[24-25]。世界范圍內(nèi)傳播的NDM陽性菌株已發(fā)現(xiàn)，給臨床管理和公共衛(wèi)生帶來了嚴重的影響[26]。 bla? NDM基因可隨著優(yōu)勢克隆株或質(zhì)粒在動物、動物性食品和人之間快速傳播[27]。因此，即便碳青酶烯類藥物被禁用于動物養(yǎng)殖和動物臨床，在動物中也會出現(xiàn)NDM陽性細菌的報道，首次報道是2009年[28]，隨后全球多個國家和地區(qū)相繼報道了 bla? NDM 基因的發(fā)現(xiàn)[29]。近幾年，我國個別地區(qū)動物群中NDM陽性細菌報道較多[30-32]。2020年王剛等首次報道西藏地區(qū)存在產(chǎn)ESBLs大腸桿菌菌株[7]。本研究對牦牛源出血性大腸桿菌進行7類18種抗菌藥物耐藥表型檢測，結(jié)果耐藥率達到50%以上的有7種藥物，其中青霉素耐藥率最高，達到100%。14株被檢菌株對碳青霉素烯類（亞胺培南）、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮、多黏菌素B和頭孢西丁等7種藥物敏感率100%。本次檢測的奎諾酮類藥物、頭霉素類及大部分頭孢菌素類的耐藥表型結(jié)果與王剛等報道西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的耐藥檢測結(jié)果[7]一致，但頭孢噻肟的耐藥性結(jié)果完全相反，這可能與被檢大腸桿菌的種類不同有一定的關(guān)系。另外，測試了14株分離菌ESBLs基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)僅有3株大腸桿菌攜帶 bla? TEM基因，攜帶率21.43%（3/14），其余菌株均未檢測到ESBLs基因，這與本次試驗?zāi)退幈硇徒Y(jié)果一致。

王剛等報道西藏牦牛源腸產(chǎn)毒性大腸桿菌ESBLs基因檢出率為55.3%，其中，TEM檢出率為78.9%[7]，王警等報道江蘇奶牛源大腸桿菌ESBLs基因檢出率為11.2%，其中TEM檢出率為100%[9]。本次西藏牦牛源腸出血大腸桿菌ESBLs基因檢出率7.14%，TEM檢出率為21.43%，檢出率遠低于以上報道的結(jié)果。而佟盼盼等報道新疆牛源產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌ESBLs基因鑒定，結(jié)果ESBLs檢出率為1.91%，并說明檢測到的主要是 bla? TEM和 bla? CTX-M[33]，本次結(jié)果與之一致。

HPI是一個強毒力島，含有HPI的大腸桿菌毒力要高于不含HPI的大腸桿菌，因此，HPI可能增強細菌的致病力。牦牛腹瀉病是西藏地區(qū)牦牛主要傳染病之一，對牦牛的生產(chǎn)帶來很大的危害。其中，大腸桿菌是牦牛腹瀉病的主要病原菌。本研究首次對西藏地區(qū)分離鑒定的14株牦牛源腸出血性大腸桿菌進行HPI的主要基因檢測，填補了這一研究數(shù)據(jù)空白。此外，監(jiān)測了西藏地區(qū)牦牛源腸出血性大腸桿菌ESBLs基因的攜帶情況，可為西藏牦牛致病性大腸桿菌引起的腹瀉病防治提供理論支撐。

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