青藏高原東部22株栽培與野生羊肚菌的分子進(jìn)化分析

杜軍華 姜東伯 張津京 余建平 宋長(zhǎng)新 劉甜 陳輝 陳群 吳曉明

摘要：為了更好地區(qū)分不同羊肚菌菌株，確定其生物多樣性，對(duì)10個(gè)栽培羊肚菌和12個(gè)野生羊肚菌進(jìn)行分析。通過對(duì)5個(gè)基因區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序，借助數(shù)據(jù)庫檢索、多序列比對(duì)和分子進(jìn)化等方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10種栽培樣本屬于3種已知物種：六妹羊肚菌（ Morchella sextelata ）、梯棱羊肚菌（ M. importuna ）、七妹羊肚菌（ M. septimelata ）。同GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中已測(cè)序樣本相比，這些樣本都含有一定程度的序列差異，體現(xiàn)在栽培的樣本也具有遺傳多樣性。12個(gè)野生型樣本同六妹羊肚菌、小海綿羊肚菌（ M. spongiola ）、 Morchella prava 物種更接近，并顯示出較大的序列差異，其中1株同所有已知羊肚菌品種均有較大的遺傳差異?？紤]到這些野生羊肚菌的生長(zhǎng)地域同其他羊肚菌生長(zhǎng)地域的差異，推斷由于獨(dú)特的地理環(huán)境，使野生羊肚菌演化出了特有的基因序列。本研究獲得了青海一些地區(qū)羊肚菌的分類、分子演化和多樣性特征，有助于鑒定、選育適合栽培的羊肚菌菌株。

關(guān)鍵詞：子囊菌類;羊肚菌;分子進(jìn)化;多序列比對(duì);青藏高原;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S646.702? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）07-0028-07

收稿日期：2021-06-15

基金項(xiàng)目：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究（編號(hào)：2018-ZG-790）。

作者簡(jiǎn)介：杜軍華（1965—），男，河北故城人，副教授，主要從事生物技術(shù)及應(yīng)用研究。E-mail：djh319@126.com。

通信作者：杜軍華，副教授，主要從事生物技術(shù)及應(yīng)用研究，E-mail：djh319@126.com;吳曉明，博士，副教授，主要從事生物信息研究，E-mail：wxm@mail.xjtu.edu.cn。

羊肚菌是公認(rèn)的最重要的野生食用、藥用真菌之一，分布于世界各地，特別是在北溫帶地區(qū)[1-2]。其口感脆嫩，風(fēng)味獨(dú)特，富含維生素、人體必需氨基酸和特殊的多糖成分，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[3-5]。目前我國已報(bào)道的羊肚菌種類較多，其中常見的有圓錐羊肚菌（ Morchella conica）、小頂羊肚菌（M. angusticeps）、羊肚菌（M. esculenta）、褐色羊肚菌（M. umbrina ） 等[6]。近年來，人們對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性和物種多樣性研究取得了重大進(jìn)展，一些羊肚菌品種也已被廣泛栽培，顯示出良好的經(jīng)濟(jì)效益[7]。

目前，僅有13種羊肚菌品系完成全基因組測(cè)序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/organism/5193/），而已知羊肚菌屬（NCBI數(shù)據(jù)庫taxid編號(hào)：5193）包含多達(dá)30個(gè)物種，每個(gè)物種都有不同的菌株。目前Index Fungorum數(shù)據(jù)庫（http：//www.indexfungorum.org/Names/Names.asp） 也收錄了多達(dá)353種羊肚菌（截至2021年12月）。許多菌株在形態(tài)上相似，難以區(qū)分，利用基因序列準(zhǔn)確鑒定羊肚菌的種類和菌株尤為重要。

羊肚菌屬的分類研究已有多年，其子囊體的外觀常隨環(huán)境、氣候等外界條件的變化而變化，在形狀和大小上具有高度的多態(tài)性。雖然子實(shí)體的微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，但從屬類群的定義非常困難，菌株之間的定義也不明確，影響了該類群資源的合理利用和開發(fā)[8-9]。對(duì)于分類學(xué)家和野外真菌學(xué)家來說，羊肚菌屬于一個(gè)非常復(fù)雜的屬。由于形態(tài)差異不明顯，同一種類的羊肚菌由于生存環(huán)境和營養(yǎng)條件的差異往往表現(xiàn)出形態(tài)多樣性，根據(jù)外觀和形態(tài)對(duì)羊肚菌進(jìn)行分類往往存在一定偏差。

基于多基因位點(diǎn)進(jìn)行分析已經(jīng)成為推斷羊肚菌物種的新方法。使用ITS-RPB1-RPB2-EF1-α組合數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因分析，人們已經(jīng)將羊肚菌分為黑羊肚菌分支（ Elata clade ）、黃羊肚菌分支（ Esculenta clade ）、變紅羊肚菌分支（ Rufobrunnea clade ）[10-11]。拉丁二項(xiàng)命名法也已用于羊肚菌命名，即用 Mes（E. clade）或Mel（E. clade） 跟上一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字表示，自2012年以來也被廣泛使用。迄今為止，已經(jīng)利用系統(tǒng)發(fā)生分析的方法，確定了68個(gè)羊肚菌品種的關(guān)系，包括38個(gè)屬于黑羊肚菌、28個(gè)屬于黃羊肚菌、2個(gè)變紅羊肚菌[3，12-13]?；谶@些已知物種的命名，有助于準(zhǔn)確地進(jìn)行其他羊肚菌品種的鑒定。

在青海地區(qū)高緯度和寒冷的氣候條件下，動(dòng)植物已經(jīng)進(jìn)化出了獨(dú)特的生長(zhǎng)模式。該地區(qū)的土壤特性和生態(tài)系統(tǒng)，也成為野生羊肚菌的良好生長(zhǎng)環(huán)境。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，適合栽培的羊肚菌新品種也需要不斷被篩選出來，以促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。為了更好地了解青海地區(qū)羊肚菌的菌株類型、分布特點(diǎn)、分子標(biāo)記和進(jìn)化特征，筆者對(duì)22個(gè)樣本進(jìn)行分類相關(guān)基因的測(cè)序，通過序列比較的方法，以確定菌株特點(diǎn)及其遺傳特征。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

本研究于2020年5月，在大巴山東部地區(qū)北山農(nóng)場(chǎng)共收集了107個(gè)樣本。經(jīng)過基于形態(tài)的初步篩選，選取其中有代表性的12個(gè)野生菌株，繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行分子水平的分析和鑒定。同時(shí)，筆者也從青海省西寧市周圍的羊肚菌栽培基地，選取了10個(gè)栽培品種，進(jìn)行菌株的亞種鑒定。樣本信息見表1、表2。

1.2 DNA測(cè)序區(qū)域的選擇

為對(duì)10個(gè)栽培品種和12個(gè)野生品種進(jìn)行進(jìn)化分析和分子鑒定，本研究對(duì)5個(gè)突變率較高的基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行了測(cè)序。這些區(qū)域是rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its1～its4 （ITS）、編碼RNA聚合酶Ⅱ的最大亞基（RPB1）、編碼RNA聚合酶Ⅱ的第二大亞基（RPB2）、翻譯延伸因子 （EF1-α）、核糖體大亞基（LSU）。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取分離后，將凝膠中的DNA樣品切割純化，回收目的片段，用相應(yīng)的引物和合適的條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增（表3、表4），擴(kuò)增程序根據(jù)引物退火與片段大小做適當(dāng)調(diào)整，擴(kuò)增后的分子進(jìn)行測(cè)序，最終共獲得122條序列。

1.3 生物信息學(xué)分析

為了獲取樣本測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的相似序列，本研究利用基于局部比對(duì)算法的搜索工具（BLAST）進(jìn)行同源序列檢索，利用MUSCLE多序列比對(duì)程序確定各條序列的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用MEGA等軟件分析樣品序列的親緣關(guān)系。

1.3.1 數(shù)據(jù)庫同源序列獲取

為了檢測(cè)已測(cè)序片段與已知序列的相似性，并確定其同源序列，使用序列相似性搜索程序BLASTN[14]，設(shè)置查詢參數(shù)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取同源序列。對(duì)搜索結(jié)果中同一樣本的不同片段進(jìn)行合并以剔除重復(fù)結(jié)果，只保留物種屬于羊肚菌屬的序列進(jìn)行進(jìn)化分析。對(duì)于 ITS 基因，從SD樣本和DM樣本共檢索到422個(gè)不同物種的序列。另外3個(gè)基因RPB1、RPB2、EF1-α檢索到的同源序列分別為142、156、127條。

1.3.2 基于索引號(hào)的羊肚菌測(cè)序序列獲取

一些研究人員從事羊肚菌相關(guān)研究，其樣本的測(cè)序序列也已被上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫[4，15-18]，總共獲得162個(gè)序列ID。筆者使用shell腳本編程，并借助查詢工具E-utilities （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/home/tools/）下載相關(guān)的序列，過濾后，共得到110個(gè)樣本，包含所有4個(gè)基因序列。

1.3.3 多序列比對(duì)

使用MUSCLE[19]來進(jìn)行多序列比對(duì);使用BioEdit 7.2.6進(jìn)行序列編輯操作;使用Gblock（http：//phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/）進(jìn)行位點(diǎn)選擇[3]。

1.3.4 序列替代模型選擇

用IQ-tree中的ModelFinder[20]來找到最佳核苷酸替換模型。該模型基于Bayesian信息準(zhǔn)則（BIC）進(jìn)行模型參數(shù)的篩選。ITS-rpb1-rpb2-ef1α的最佳DNA替換模型為K2P+G4，表示堿基的轉(zhuǎn)換、顛換有不同的頻率。進(jìn)化樹的構(gòu)建和可視化采用MEGA軟件[21]。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

采用基于Tamura-Nei模型[22]的最大似然方法進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。算法根據(jù)一個(gè)初始樹進(jìn)行啟發(fā)式搜索，保留似然性較好的系統(tǒng)發(fā)生樹作為最終結(jié)果。根據(jù)每個(gè)位置的替換次數(shù)得到樹中的分支長(zhǎng)度，并用1 000次bootstrap重復(fù)估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生樹中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于RPB1基因的羊肚菌親緣關(guān)系

對(duì)22個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序，成功獲得ITS、RPB1、RPB2、EF1-α、LSU序列。對(duì)低質(zhì)量測(cè)序結(jié)果過濾后，共得到122個(gè)片段，總長(zhǎng)度為76 kb。

RPB1基因在每個(gè)樣品中都被成功測(cè)序，用它查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，得到多個(gè)羊肚菌屬的同源序列。經(jīng)過篩選，并對(duì)于每個(gè)羊肚菌品系保留1～2條序列，然后用MUSCLE程序構(gòu)建多序列比對(duì)。利用MEGA和最大似然法進(jìn)行進(jìn)化分析，最終得到了1棵包含22個(gè)樣本和111個(gè)已知物種或菌株同源序列的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)生樹。初步確定了樣品與已知羊肚菌品種之間的進(jìn)化關(guān)系，并使用FigTree 1.4.4 （http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）來顯示進(jìn)化樹，體現(xiàn)品種之間的類別關(guān)系（圖1）。

如圖1所示，在區(qū)域1中可以發(fā)現(xiàn)樣本DMBJD039、DMBXY044和DMBXY049具有非常高的同源性關(guān)系，與sp._Mel-29和sp._Mel-28非常接近。從形態(tài)上，這3個(gè)品種區(qū)分為尖頂羊肚菌和小羊肚菌。

在區(qū)域2中，含有DMBBY003、DMBHH076、DMBHM034的分支被鑒定為六妹羊肚菌。栽培株SDQYXZ001（圖2）、SDQYNS006、SDQYMK009、SDQYDB005和SDQYBS010也存在于該分支。這些栽培株來自西藏林芝、湖北恩施、青海班瑪、甘肅迭部、青?；ブ鹊?，表明此品種羊肚菌具有較高的適應(yīng)性。

在區(qū)域3中，栽培菌株SDQYSC004和SDQYTL008分別來自四川金堂和青海西寧。它在進(jìn)化上與同七妹羊肚菌相似，具有較高的同源性。

在區(qū)域4中，3個(gè)栽培株SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002和2個(gè)野生菌株DMBHH052、DMBHM088與梯棱羊肚菌具有較高的同源性。SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002分別來自青海西寧、甘肅天水、甘肅卓尼。這表明梯棱羊肚菌也適宜在2 000 m的高海拔地區(qū)栽培。

區(qū)域5中，DMBBY014、DMBMM064、DMBCB101和DMBMM005與sp._Mes-5和sp._Mes-6最接近，但分支較長(zhǎng)，表現(xiàn)出種間的差異。從形態(tài)上，4個(gè)品種有所區(qū)別，被認(rèn)為是半圓羊肚菌、羊肚菌、粗柄羊肚菌等，因此，有必要進(jìn)一步確定其種類信息。

由于RPB1基因在多數(shù)樣本中具有較高同源性，一些樣本不能很好地區(qū)分，需借助更多基因序列進(jìn)行鑒定。

2.2 基于多基因序列組合的樣本親緣關(guān)系分析

本研究對(duì)SD樣本（表1）和DM樣本（表2）均進(jìn)行多基因測(cè)序，以此進(jìn)行多基因綜合分析。對(duì)所有樣本先進(jìn)行多序列比對(duì)（multiple sequence alignment，簡(jiǎn)稱MSA），再將單個(gè)基因MSA結(jié)果合并成多基因MSA結(jié)果，以確定樣本之間的關(guān)系。

10個(gè)SD樣本擴(kuò)增出RPB1和 EF1-α 基因，并獲得了測(cè)序結(jié)果。因此，筆者構(gòu)建了包含這2個(gè)基因的MSA，并選擇Tamura-Nei模型作為DNA替代模型構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。

單基因分析提供的分辨率不高，很難區(qū)分物種之間的詳細(xì)差異，而通過雙基因進(jìn)化分析，可以清楚地看到樣本之間存在差異。在圖3中，這棵樹可以分為3個(gè)分支，分別屬于3個(gè)不同的物種。各分枝間樣品間也存在一定的進(jìn)化距離，說明在青海成功培植的羊肚菌種也有種間差異。

對(duì)于野生型DM樣本，所有樣本中成功測(cè)序的基因有3個(gè)，分別是RPB1、RPB2、LSU。利用這些基因的MSA構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖4所示。

12個(gè)DM樣品在形態(tài)上有很大差異，說明它們屬于不同的物種。從進(jìn)化樹中可以看到4個(gè)分支，每個(gè)分支與其他分支之間的距離都很大，所以筆者認(rèn)為其中有超過4個(gè)不同的物種。特別是，樣本DMBMM064有一個(gè)更長(zhǎng)的分支，這意味著該樣本與其他樣本差異更大。

2.3 基于多基因數(shù)據(jù)庫搜索的樣本品系推測(cè)

通過在數(shù)據(jù)庫中搜索單個(gè)基因序列來識(shí)別物種，將會(huì)由于序列相似性而檢索出多個(gè)不同結(jié)果，這給確定樣本的種類帶來了巨大困難。因此，本研究結(jié)合了各樣本中多個(gè)基因的序列相似性搜索結(jié)果以及形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了樣本推斷。使用BLAST來進(jìn)行同源序列搜索，在查詢參數(shù)中，設(shè)置物種限定為羊肚菌屬（ Morchella ），然后提取每個(gè)查詢結(jié)果的物種信息，并根據(jù)每個(gè)樣本的多基因搜索結(jié)果確定羊肚菌品種，獲得最接近的物種（表5、表6）。

2.4 同已文獻(xiàn)報(bào)道羊肚菌品系的關(guān)系

為了研究青海羊肚菌與其它報(bào)道品種之間的關(guān)系，從文獻(xiàn)檢索到序列的索引號(hào)，并從GenBank提取了162個(gè)樣本的基因序列。在本研究的樣本中，有20個(gè)包含同文獻(xiàn)匹配的4個(gè)基因序列區(qū)域。經(jīng)過序列比對(duì)和分子進(jìn)化分析，得到進(jìn)化樹（圖5）。

可以看出，本研究的樣品與報(bào)道的羊肚菌的遺傳距離較大。這也說明青海互助縣北山野生羊肚菌具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化系統(tǒng)，且存在種群隔離的趨勢(shì)。DM樣品是野外采集的野生樣品，可以看出DM樣品之間的差異大于SD樣品。

2.5 典型的序列差異

為了識(shí)別樣本序列和現(xiàn)有已知羊肚菌品種的序列差異，筆者進(jìn)行了序列比較。對(duì)于RPB1基因，合并了133個(gè)羊肚菌同源序列，它們是SD樣本、DM樣本和從數(shù)據(jù)庫檢索得到的同源序列。MSA比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMBMM064與其他序列有相對(duì)較大的遺傳差異。將此序列與最接近的樣本序列JQ322139.1進(jìn)行了比較，獲得點(diǎn)陣圖分析結(jié)果如圖6所示，紅圈中的線是不連續(xù)的，這意味2個(gè)樣本中的RPB1基因序列不同，表明2個(gè)樣本有很大的進(jìn)化距離。

如圖7所示，該樣本序列同數(shù)據(jù)庫序列的比對(duì)結(jié)果，是匹配度最高的結(jié)果，尚且存在一些差異，顯示出本樣本獨(dú)特，其功能和特征還需進(jìn)一步的探索。

3.6 形態(tài)和地理分布

本研究發(fā)現(xiàn)，青海野生羊肚菌有較高的序列多樣性，與其他已知的羊肚菌品種相比，包含DMBBY014、DMBMM064和DMBMM005的分支，有更高的序列差異和較長(zhǎng)的進(jìn)化距離，可能包含新的品系和菌株，較高的品系多樣性，為羊肚菌的栽培和推廣提供較好的遺傳資源。

3 討論與結(jié)論

在本研究收集了22個(gè)羊肚菌樣本，并為每個(gè)樣本進(jìn)行了5個(gè)基因區(qū)域的測(cè)序。根據(jù)樣本的測(cè)序結(jié)果，結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的同源序列，并進(jìn)行進(jìn)化分析，探索它們之間的差異。結(jié)果表明，栽培樣本包括3個(gè)主要品種，分別是六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌，這些品種均屬于黑色羊肚菌支系，是我國食用菌栽培行業(yè)發(fā)展迅速的一類真菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值[23]。栽培樣本的DNA序列同數(shù)據(jù)庫已有條目相比，存在一定程度的序列變異，表明具有一定序列變異的品種，已能夠很好地適應(yīng)當(dāng)?shù)胤N植環(huán)境，某些位點(diǎn)的變化不會(huì)影響羊肚菌生長(zhǎng)的適應(yīng)性。

對(duì)于野生羊肚菌樣本，它們同已知的物種有更高的序列位點(diǎn)差異，在野生品種之間也有較大的遺傳距離，這表明它可能含有新的羊肚菌菌株或新的羊肚菌品種。與此同時(shí)，這些野生樣本收集自較小范圍的特定地理區(qū)域，該區(qū)域同其他羊肚菌的生長(zhǎng)區(qū)域相隔很遠(yuǎn)，這也體現(xiàn)出特定的環(huán)境有助于進(jìn)化出這些新的羊肚菌菌株。

序列比較也發(fā)現(xiàn)了樣本序列和數(shù)據(jù)庫條目之間的一些差異。例如，DMBMM064與所有已知物種的遺傳距離相對(duì)較大，這表明它經(jīng)歷了較長(zhǎng)的分化時(shí)期，可能是新的羊肚菌品種。多方面的全面分析將非常有必要。全基因組測(cè)序和基因功能研究將有助于發(fā)現(xiàn)新品種及其功能特征，這對(duì)培養(yǎng)野生的新菌株也非常重要。

本研究初步鑒定了22個(gè)適合在中國北方生長(zhǎng)的羊肚菌樣本，擴(kuò)大了筆者對(duì)羊肚菌屬的多樣性和分布特點(diǎn)的了解，這對(duì)于選育和栽培羊肚菌新品種，獲得經(jīng)濟(jì)效益，更深入、全面的分子水平分析將非常有幫助。

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