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    基于“藥輔合一”的桉葉油乳膏的制備及藥效研究

    2022-05-08 23:53:08郭雪陳金素許蕊蕊王秀麗
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2022年4期
    關(guān)鍵詞:桉葉油硬脂酸乳膏

    郭雪,陳金素,許蕊蕊,王秀麗*

    1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 102488;2.云南省中醫(yī)醫(yī)院,云南 昆明 650021

    桉葉油是桉樹葉油腺細(xì)胞分泌的一種植物精油,主要藥效成分包括桉葉油素、芳樟醇和α-蒎烯[1]?,F(xiàn)代研究表明,桉葉油具有抗菌、消炎的作用,對(duì)炎癥反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié),如體內(nèi)炎性介質(zhì)釋放、毛細(xì)血管通透性增加等均有影響[2],被廣泛用于治療肺結(jié)核、糖尿病、哮喘等疾病[3]。除此之外,桉葉油中還含有多種單萜類和倍半萜化合物及衍生物,這些萜類化合物均具有止血、止痛等作用[4]。

    關(guān)于桉葉油的抗炎、抑菌、抗氧化和鎮(zhèn)痛止癢活性已有較多研究[5-12],但未見基于“藥輔合一”的理念將桉葉油同時(shí)作為藥效物質(zhì)與油相、促透劑制成乳膏并對(duì)其抗炎、鎮(zhèn)痛及抑菌效果進(jìn)行研究的報(bào)道。

    本研究基于“藥之為輔”的設(shè)計(jì)應(yīng)用規(guī)律,設(shè)計(jì)并優(yōu)化了桉葉油乳膏的處方工藝。處方中的桉葉油為具有抗炎、抗菌作用的油狀液體,替代乳膏中的有機(jī)溶劑充當(dāng)油相,同時(shí)還可作為促透劑增加藥物的經(jīng)皮滲透性,兼有充當(dāng)制劑油相、促進(jìn)滲透與治療疾病的三重特點(diǎn)。

    乳膏劑的基質(zhì)對(duì)皮膚表面分泌物的分泌和水分的蒸發(fā)影響較小,同時(shí)可以均勻溶解藥物有效成分,涂抹于皮膚后可以使有效成分均勻釋放,更好地發(fā)揮藥物療效。

    鑒于此,本研究基于“藥輔合一”的理念篩選桉葉油乳膏處方工藝,既發(fā)揮桉葉油抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛止癢等藥理活性,又發(fā)揮其脂溶性和促滲透特性,拓展了桉葉油的應(yīng)用范圍,為植物揮發(fā)油作為藥用輔料的進(jìn)一步研究提供了參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    FA1204B 型分析天平(上海精密儀器儀表有限公司);Sorall ST 8R 型高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司);SHHW21-600 型電熱三用水箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責(zé)任公司);BCD-519WEZ50型TCL 電冰箱(TCL 家用電器有限公司);101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)儀器分析制造廠);SDPTOP SZN 型解剖顯微鏡(尼康株式會(huì)社);BBS-SDC 型超凈臺(tái)(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司);揮發(fā)油提取器(河南九和共創(chuàng)儀器有限公司);打孔器(上海遠(yuǎn)卓文教用品有限公司)。

    1.2 試藥

    硬脂酸(批號(hào):CG10070082,北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司);單硬脂酸甘油酯(批號(hào):C10286479,上海麥克林生化科技有限公司);甘油(批號(hào):000619,北京化學(xué)試劑公司);月桂氮?酮(批號(hào):Z13J10Y93008,上海源葉生物科技有限公司);十二烷基硫酸鈉(批號(hào):1202021,廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心);桉葉油(吉安駿馬香料有限公司);冰片(批號(hào):76747220,上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司);復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山何濟(jì)公制藥廠);二甲苯(批號(hào):20091020,重慶川東化工集團(tuán)有限公司);大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌(批號(hào)分別為19089037、17121207,北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)昆明種小鼠120只,雄性,體質(zhì)量18~22 g,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002,購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,經(jīng)過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(BUCM-4-2019091004-3105),飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。

    2 方法

    2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選桉葉油乳膏基質(zhì)處方

    2.1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,桉葉油、硬脂酸及單硬脂酸甘油酯三者的用量會(huì)對(duì)桉葉油乳膏的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。因此,正式試驗(yàn)中以桉葉油的用量(A)、硬脂酸的用量(B)和單硬脂酸甘油酯的用量(C)為自變量,以綜合評(píng)分(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),每個(gè)因素設(shè)計(jì)高、中、低3個(gè)水平,見表1。

    表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選桉葉油乳膏基質(zhì)處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2.1.2考察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法 在桉葉油乳膏處方篩選過(guò)程中,將乳膏的外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性作為乳膏質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo),綜合評(píng)分為5 個(gè)指標(biāo)得分之和。各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)方法:1)外觀均一性。觀察桉葉油乳膏顏色、質(zhì)地是否均勻,靜置是否會(huì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象;2)涂布延展性。觀察桉葉油乳膏涂布過(guò)程中有無(wú)結(jié)塊與顆粒;3)離心穩(wěn)定性。將桉葉油乳膏4000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5 cm),觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象;4)耐寒穩(wěn)定性。取桉葉油乳膏于-20 ℃條件下放置24 h,取出放至室溫,觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象;5)耐熱穩(wěn)定性。取桉葉油乳膏置于50 ℃恒溫箱中,恒溫放置6 h,觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象[13],具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

    表2 桉葉油乳膏基質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    2.2 粒度測(cè)定

    取3批桉葉油乳膏適量,涂成薄層,薄層面積相當(dāng)于蓋玻片的面積,覆以蓋玻片,每個(gè)批號(hào)涂3 片,按《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版(四部)附錄通則0982第一法測(cè)定。

    2.3 二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

    昆明種小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分為低、中、高劑量桉葉油乳膏組,陽(yáng)性對(duì)照組及空白乳膏組5組,每組10 只。低、中、高劑量藥物組按小鼠體質(zhì)量分別在小鼠右耳耳廓給予桉葉油乳膏0.5、1.0、2.0 g·kg-1,陽(yáng)性對(duì)照組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏1.0 g·kg-1,空白乳膏組在小鼠右耳耳廓均勻涂抹空白乳膏1.0 g·kg-1,每天3次,連續(xù)3 d。第4 天涂藥1 h 后,對(duì)各組小鼠右耳給予二甲苯致炎,每只0.05 mL,1 h 后將小鼠脫頸椎處死,剪下雙耳,用直徑為8 mm打孔器將雙耳相同部位打下圓耳片,稱質(zhì)量,以左耳作對(duì)照,左右耳片質(zhì)量差為腫脹程度,計(jì)算各組腫脹度,求出腫脹抑制率。

    2.4 熱板實(shí)驗(yàn)

    將熱板儀的溫度設(shè)置為(55.0±0.5)℃,將小鼠置于熱板儀上,觀察并記錄從小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間,將此時(shí)間定義為該小鼠的痛閾值,5 s<痛閾值<30 s 的小鼠為合格。選取痛閾值合格的小鼠50 只,隨機(jī)分為低、中、高劑量桉葉油乳膏組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白乳膏組共5 組,每組10只。測(cè)定各組小鼠給藥前痛閾值,然后低、中、高劑量藥物組分別給予小鼠0.2、0.4、0.6 g/只桉葉油乳膏涂抹雙后足,陽(yáng)性對(duì)照組小鼠給予0.2 g/只的復(fù)方醋酸地塞米松乳膏,空白乳膏組小鼠給予0.2 g/只的空白乳膏。然后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè),連續(xù)給藥2 次,每次間隔0.5 h,在末次給藥1.0、1.5、2.0 h后測(cè)定其痛閾值,記錄小鼠給藥前后痛閾值并計(jì)算鎮(zhèn)痛率[14]。

    2.5 體外抑菌試驗(yàn)

    從-80 ℃冰箱取凍存的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌菌種,室溫解凍,在安全柜中用滅菌后的接種環(huán)蘸取少量菌液,在已冷卻凝固的瓊脂板上劃線接種細(xì)菌,將劃線的瓊脂板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑選單個(gè)生長(zhǎng)狀況良好的菌落接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫振蕩,培養(yǎng)箱中孵育6 h,再用滅菌后的液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液吸光度為0.1后備用。

    取無(wú)菌液體培養(yǎng)基20 mL 于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中,室溫冷凝固化。取備用菌液50 μL,均勻涂布于培養(yǎng)基表面,用直徑為6 mm的打孔器在中央位置打孔,并用所制高、中、低劑量的桉葉油乳膏填滿缺孔,密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出測(cè)量抑菌環(huán)直徑。每個(gè)劑量均設(shè)3個(gè)平行組。

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以()表示,采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 處方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    3.1.1Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

    表3 桉葉油乳膏基質(zhì)處方試驗(yàn)設(shè)計(jì)與評(píng)分結(jié)果

    3.1.2模型擬合 采用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以Y對(duì)自變量進(jìn)行模型擬合,并通過(guò)相關(guān)系數(shù)(r)等對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià),通過(guò)比較各擬合方程的擬合度,得到回歸方程:Y=93.40+3.25A+1.38B+2.63C-3.50AB-6.00AC-9.75BC-7.08A2-6.82B2-10.82C2,方差分析見表4。由此可知,r=0.968 6,P<0.01,F(xiàn)值為24.01,這表明模型具有極顯著差異性;失擬P=0.095 8>0.05,失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明該模型擬合度和可信度均有效,實(shí)驗(yàn)誤差小,可用此模型對(duì)桉葉油乳膏處方進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

    3.1.3響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程,通過(guò)Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評(píng)價(jià)指標(biāo)隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖(圖1~3)。

    由圖1~3 可以看出,桉葉油、硬脂酸和單硬脂酸甘油酯三者的用量對(duì)綜合評(píng)分均呈拋物線形,即隨著三者用量的逐漸增大,綜合評(píng)分均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),因此,在桉葉油乳膏的制備工藝中適當(dāng)增加三者的用量可以提高綜合評(píng)分。與此同時(shí),由表4 可知,硬脂酸的用量對(duì)綜合評(píng)分的影響小于桉葉油與單硬脂酸甘油酯的用量對(duì)綜合評(píng)分的影響,隨著硬脂酸用量的增加,綜合評(píng)分先是升高,繼而緩慢降低,因此,在桉葉油乳膏的制備中應(yīng)控制硬脂酸的用量在最佳范圍內(nèi)。

    圖1 桉葉油用量和硬脂酸用量對(duì)綜合評(píng)分的影響

    表4 桉葉油乳膏多元回歸模型方差分析結(jié)果

    結(jié)合回歸模型分析和實(shí)際操作過(guò)程中的可行性,各因素值保留為1位小數(shù),桉葉油乳膏的最優(yōu)基本基質(zhì)配方:桉葉油的用量為1.1 g、硬脂酸的用量為1.0 g、單硬脂酸甘油酯的用量為1.6 g。

    3.2 乳膏的制備

    將硬脂酸1.0 g、單硬脂酸甘油酯1.6 g、桉葉油1.1 g、月桂氮?酮0.13 g、冰片2.0 g 放置于容器內(nèi),水浴加熱至熔化,繼續(xù)加熱至70~80 ℃;另取十二烷基硫酸鈉0.30 g、甘油0.75 g 和蒸餾水適量(加至乳膏總量10.0 g),加熱至70~80 ℃,緩緩倒入硬脂酸等油相中,邊加邊攪拌,至乳化完全,放冷即得??瞻兹楦嗟闹苽涫菍⑻幏街械蔫袢~油用無(wú)藥效作用的中鏈甘油三酸酯代替。中劑量乳膏中,含桉葉油0.80 g,中鏈甘油三酸酯0.30 g。低劑量乳膏中,含桉葉油0.60 g,中鏈甘油三酸酯0.50 g。

    3.3 粒徑考察結(jié)果

    按照《中國(guó)藥典》2020 年版(四部)附錄通則0982 第一法測(cè)定粒徑,3 批樣品均未檢出>180 μm的粒子,結(jié)果見圖4。

    圖4 3批桉葉油乳膏在40倍鏡下的乳粒

    3.4 桉葉油乳膏對(duì)二甲苯致炎反應(yīng)的影響

    結(jié)果表明,與空白乳膏組相比,低、中、高劑量桉葉油乳膏組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠耳廓腫脹度均有明顯減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。表明桉葉油乳膏能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥,隨著藥物劑量的增大,抗炎效果逐漸增強(qiáng),即具有劑量依賴性,且高劑量組的抗炎效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組,提示桉葉油乳膏具有明顯抗炎的作用,結(jié)果見表5。

    表5 桉葉油乳膏對(duì)小鼠的抗炎作用結(jié)果(,n=10)

    表5 桉葉油乳膏對(duì)小鼠的抗炎作用結(jié)果(,n=10)

    注:與空白乳膏組比較,*P<0.05,**P<0.01;表6同。

    圖2 桉葉油用量和單硬脂酸甘油酯用量對(duì)綜合評(píng)分的影響

    圖3 硬脂酸用量和單硬脂酸甘油酯用量對(duì)綜合評(píng)分的影響

    3.5 桉葉油乳膏對(duì)物理性致痛的影響

    結(jié)果表明,高劑量和中劑量的桉葉油乳膏都能明顯提高小鼠的痛閾值,提高小鼠對(duì)熱板的耐受力,2 個(gè)劑量組都與空白乳膏組有明顯差異,且中劑量組提高小鼠通閾值的能力與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng),高劑量組優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組,順序?yàn)楦邉┝拷M>陽(yáng)性對(duì)照組>中劑量組>低劑量組,具體結(jié)果見表6。

    表6 桉葉油乳膏對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果(,n=10)

    表6 桉葉油乳膏對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果(,n=10)

    3.6 桉葉油乳膏體外抑菌效果

    抑菌圈直徑6 mm即為與打孔器直徑相同,無(wú)抑菌作用。抑菌圈直徑越大,抑菌作用越強(qiáng)。當(dāng)給予低劑量桉葉油乳膏時(shí),其對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈只有6.22 mm,有微弱的抑菌作用,而中高劑量的桉葉油乳膏對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈明顯增大。相比于大腸埃希氏菌,桉葉油乳膏對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用有所增強(qiáng),高劑量組抑菌圈能達(dá)到9.50 mm,抑菌效果明顯,結(jié)果見表7。

    表7 桉葉油乳膏抑菌作用(,n=3)

    表7 桉葉油乳膏抑菌作用(,n=3)

    4 討論

    角質(zhì)層主要由角質(zhì)細(xì)胞和大量填充于細(xì)胞間隙的類脂組成,是藥物透皮吸收的主要屏障。桉葉油的主要成分1,8-桉葉素為無(wú)色或黃色澄清液體,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,具有良好的脂溶性,容易穿透生物膜結(jié)構(gòu),現(xiàn)有研究表明,桉葉油是通過(guò)改變角質(zhì)細(xì)胞間類脂雙分子層結(jié)構(gòu),增加其紊亂程度從而促進(jìn)藥物滲透的[15]。因此,桉葉油不僅作為主要的有效成分在乳膏中發(fā)揮了抗炎、鎮(zhèn)痛與抑菌的作用,還作為乳膏的主要油相基質(zhì)與促透劑起到了構(gòu)建乳膏與促進(jìn)乳膏透皮吸收的作用。

    從制劑角度看,桉葉油特殊的理化性質(zhì)在桉葉油乳膏中充當(dāng)了輔料角色,充分利用其脂溶性、抑菌劑和促透劑的功能特征,輔助制劑的成型、滲透與穩(wěn)定,減少了化學(xué)輔料在乳膏中的應(yīng)用,提高了制劑的安全性和患者的順應(yīng)性,一舉多得;從治療角度看,桉葉油可以發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用,符合“藥輔合一”的理論內(nèi)涵,為桉葉油的開發(fā)和醫(yī)用提供了廣闊前景。

    5 結(jié)論

    綜上所述,本研究通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹、熱板儀小鼠致痛及大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制實(shí)驗(yàn)探討了桉葉油乳膏的抗炎、鎮(zhèn)痛及抑菌的藥理作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,本研究所制桉葉油乳膏的抗二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥作用優(yōu)于臨床上常用的消炎止癢藥方醋酸地塞米松乳膏,且可明顯提高小鼠痛閾值,效果同樣優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。抑菌實(shí)驗(yàn)表明,桉葉油乳膏對(duì)金黃色葡萄球菌與大腸埃希氏菌均有一定程度的抑制作用。桉葉油乳膏抗炎、鎮(zhèn)痛作用優(yōu)良,且兼具一定的抑菌作用。

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