基于近紅外熒光標記蛋白芯片的多腫瘤標志物聯(lián)合定量檢測技術(shù)

王志慧，項華中，鄭 剛，許穎原

（1．上海理工大學 上海市介入醫(yī)療器械工程研究中心，上海 200093；2．上海薩迦生物科技有限公司，上海 201203）

引 言

惡性腫瘤（即癌癥）的發(fā)病率、死亡率逐年升高[1]，原因是腫瘤在早期并沒有明顯的臨床癥狀，等到發(fā)現(xiàn)時已到了中晚期[2]，所以，尋求有效降低死亡率的方法尤為重要。研究表明，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低死亡率的有效途徑[3-4]，然而，常用的檢測方法，如CT、核磁共振（MRI）等，不僅對人體存在一定程度的損害，而且檢測費用昂貴[5-6]，并不適合定期檢測。研究發(fā)現(xiàn)，血清中腫瘤標志物的定量檢測對腫瘤的早期篩查、療效檢測、預后評估等方面具有重要的臨床意義[7-8]。腫瘤標志物是指因惡性腫瘤存在或機體對其反應而異常產(chǎn)生或升高的一種特征性物質(zhì)，在正常人體細胞中沒有或者含量很低[9-10]，臨床上，常把腫瘤標志物的定量檢測作為腫瘤診斷的重要輔助手段。由于腫瘤標志物的低特異性，單一腫瘤標志物不足以診斷癌癥，而多腫瘤標志物聯(lián)合檢測在成本控制、分析時間、所需樣本量等方面存在優(yōu)勢[8,11-13]，因此，多腫瘤標志物聯(lián)合檢測分析引起越來越多的關(guān)注。

多腫瘤標志物聯(lián)合檢測的分析方法主要有基于電化學發(fā)光（ECLIA）的微流控芯片檢測法[13]、基于化學發(fā)光（CLIA）的多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)[14]等?；陔娀瘜W發(fā)光的微流控芯片檢測法多用于即時檢測（POCT）領(lǐng)域，可對單人份進行快速檢測，整個檢測過程時間可控制在15 min內(nèi)，然而，該方法并不適合大規(guī)模人群的檢測?；诨瘜W發(fā)光的多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)采用雙抗體夾心的化學發(fā)光法檢測，兼具化學發(fā)光法和蛋白芯片法的優(yōu)點，即檢測背景低、成本低、檢測速度快、通量高、所需樣本量少等，但因采用化學發(fā)光法，存在易受反應環(huán)境影響、反應時間難控制等缺點。

免疫熒光分析法（IFA）[15]是腫瘤標志物檢測的常用方法之一。IFA是用熒光染料直接標記待測血清中的腫瘤標志物抗原，或用熒光染料標記的二抗與蛋白芯片上的待測抗原結(jié)合，然后通過熒光掃描儀對標記的熒光染料激發(fā)熒光信號進行分析，最后計算出待測血清中抗原的濃度。目前，IFA中用于熒光標記的多為Cy3、Cy5等處于可見光波段的熒光染料，相比于CLIA具有背景噪聲高、易受蛋白質(zhì)自發(fā)熒光的干擾等缺點。由于組織蛋白自發(fā)熒光處于可見光范圍，在近紅外波段有較低的吸收和散射[16]，因此，選用光譜處于近紅外波段的熒光染料標記腫瘤標志物的蛋白芯片法不僅具有背景噪聲低、檢測靈敏度高等優(yōu)點，同時具備通量大、易操作、成本低、特異性高、穩(wěn)定性好、檢測速度快等優(yōu)點[17]。

生物芯片掃描儀是蛋白芯片檢測的重要工具[18]，是蛋白芯片檢測的一個重要環(huán)節(jié)，通過檢測標記物上熒光信號強度的大小來定量分析血清中腫瘤標志物抗原的濃度。生物芯片掃描儀的性能對檢測結(jié)果具有重要的影響，在當下市場，并沒有專門用于近紅外熒光標記蛋白芯片的檢測儀器?；诖耍鶕?jù)蛋白芯片的特點及檢測需求，研制了用于蛋白芯片檢測的生物芯片掃描儀。與市場上存在的電化學發(fā)光或化學發(fā)光類的檢測儀器相比，該掃描儀具有信噪比高、線性范圍寬、靈敏度高、分辨率高、使用方便、可減少芯片中多人份樣本之間的交叉污染等優(yōu)點。

本文通過近紅外熒光標記蛋白芯片法定量檢測血清中的多個腫瘤標志物的含量，實現(xiàn)了多項癌癥的一次性篩查。文中詳細闡述了近紅外熒光標記蛋白芯片多腫瘤標志物的聯(lián)合定量檢測原理，并比較了10例患者血清的4項腫瘤標志物檢測與羅氏電化學發(fā)光法儀器的檢測結(jié)果，結(jié)果表明二者高度相關(guān)。

1 近紅外熒光標記蛋白芯片定量檢測原理

1.1 近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片免疫分析原理

近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片采用雙抗體夾心的近紅外熒光標記法檢測，在固相載體上按一定的順序（或方法）包被多種帶有不同腫瘤標志物靶標的抗體，捕獲被檢者血清中對應腫瘤標志物的抗原，再結(jié)合生物素化的第二抗體（即二抗），然后與近紅外熒光染料標記的鏈霉親和素進行非特異性結(jié)合，最后通過生物芯片掃描儀檢測分析，獲得被檢者血清中各項腫瘤標志物含量的生物信息，實現(xiàn)血清中多個腫瘤標志物的定量檢測。近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片免疫分析原理如圖1所示。

圖1 近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片免疫分析原理Fig. 1 The principle of immunoassay for near-infrared fluorescent-labeled multi-tumor markers protein chip

對于多孔板來說，每個孔板內(nèi)的反應相同。首先，將帶有不同腫瘤標志物靶標的捕獲抗體固定于修飾過的固相載體的指定位置上，為了提高檢測的準確性，帶有同樣腫瘤標志物靶標的捕獲抗體可重復固定幾個位置。然后加入待測血清進行孵育，捕獲抗體會與血清中相應腫瘤標志物的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，待充分反應后，清洗掉多余的血清，再加入不同腫瘤標志物生物素化的第二抗體（即二抗），二抗與之前抗體-抗原對中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，待充分的孵育反應后，清洗掉多余的二抗，再加入近紅外熒光染料標記的鏈霉親和素，鏈霉親和素與生物素之間發(fā)生非特異性結(jié)合，待充分反應后，將多余的鏈霉親和素清洗干凈。此時，近紅外熒光染料的分子數(shù)與血清中的腫瘤標志物抗原濃度正相關(guān)，熒光染料的發(fā)光強度（I）正比于熒光染料分子的摩爾消光系數(shù)（ε）、量子產(chǎn)率（Q）以及熒光染料的摩爾濃度（C）[19]，即

式中K為常系數(shù)。

對于單位體積的近紅外熒光染料，其熒光分子數(shù)（N）與近紅外熒光染料的摩爾濃度（C）之間的關(guān)系為

式中阿伏伽德羅常數(shù)NA=6.02×1023mol-1。

根據(jù)式（1）、式（2），可得

由式（3）可知，熒光染料的發(fā)光強度與熒光分子數(shù)成正比，即熒光分子數(shù)越多，發(fā)射的熒光越強。

在上述蛋白芯片反應過程中，通常會選擇指定數(shù)量的孔位，將加入待測血清這一環(huán)節(jié)用已知濃度的不同腫瘤標志物抗原取代，并按抗原濃度由低到高（或由高到低）的順序分別加入各個孔位中，其余反應過程與其他孔位相同。生物芯片掃描儀檢測分析后，根據(jù)檢測的熒光信號強度值與相應的腫瘤標志物抗原濃度作標準曲線，并得到標準曲線方程，再將待測血清的熒光信號強度代入標準曲線方程，線性回歸得到相應的抗原濃度值，最終實現(xiàn)不同腫瘤標志物抗原濃度的定量檢測。

1.2 生物芯片掃描儀的工作原理及設(shè)計

生物芯片掃描儀的結(jié)構(gòu)主要由光學系統(tǒng)、運動掃描系統(tǒng)、電氣控制系統(tǒng)、信號處理放大系統(tǒng)和軟件分析系統(tǒng)5部分構(gòu)成，其工作原理如圖2所示。

圖2 生物芯片掃描儀工作原理Fig. 2 Working principle of biochip scanner

生物芯片掃描儀采用激光共聚焦原理結(jié)合機械掃描的方式完成近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片的掃描成像。電氣控制系統(tǒng)控制光學系統(tǒng)中激光器的溫度和電流，使得激光器能夠穩(wěn)定地工作，激發(fā)光路激發(fā)腫瘤標志物上的熒光染料產(chǎn)生熒光信號，經(jīng)發(fā)射光路收集、光電轉(zhuǎn)換后變?yōu)殡娦盘?，再?jīng)信號處理放大系統(tǒng)的信號放大、濾波、A/D轉(zhuǎn)換，進入軟件分析系統(tǒng)成像。近紅外熒光標記多腫瘤標志物蛋白芯片位于運動掃描系統(tǒng)中X軸的載物平臺，電氣控制系統(tǒng)控制運動系統(tǒng)三軸的走位和掃描，完成整個蛋白芯片的掃描。

為了實現(xiàn)多孔位的單獨反應，近紅外熒光標記蛋白芯片采用固定裝置將固相載體上的各個微陣列隔開，同時，為了使反應更充分，固定裝置需要有一定的深度容納足夠多的反應液。待反應結(jié)束后，檢測蛋白芯片時，需要去除固定裝置，這樣不僅使得操作復雜，而且容易損壞芯片，造成芯片中不同人份樣本之間的交叉感染。所以，在設(shè)計儀器時，需考慮固定裝置的尺寸、檢測的要求以及能容忍的最大軸向分辨率等因素[20]。

因此，在對上述因素綜合考慮的基礎(chǔ)上，并結(jié)合近紅外熒光染料的吸收發(fā)射光譜等條件，對光學系統(tǒng)中的元器件參數(shù)進行選型設(shè)計，最終研制出了可用于近紅外熒光標記蛋白芯片檢測的生物芯片掃描儀（生物芯片掃描儀的詳細工作原理及光路設(shè)計請查閱參考文獻[17]中1.3節(jié)《生物芯片掃描儀的檢測原理》）。

2 血清檢測實驗和結(jié)果

2.1 血清檢測實驗

選用文中介紹的近紅外熒光標記蛋白芯片（上海薩迦生物科技有限公司蛋白芯片試劑盒）檢測10例不同患者樣本血清（血清樣本來自醫(yī)療機構(gòu)：上海薩迦生物科技有限公司），用生物芯片掃描儀分析檢測數(shù)據(jù)；用羅氏電化學發(fā)光全自動免疫分析儀（cobas e411）對同樣的樣本血清按指標糖類抗原（CA125）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA19-9）、甲胎蛋白（AFP）的順序分別進行檢測，比較兩儀器的測量結(jié)果。

2.2 結(jié)果和討論

生物芯片掃描儀對蛋白芯片試劑盒進行檢測，得到CA125、CEA、CA19-9、AFP的標準曲線，如圖3所示。

利用羅氏電化學發(fā)光全自動免疫分析儀（cobas e411）和近紅外熒光標記蛋白芯片法對10例樣本血清4項腫瘤標志物的檢測結(jié)果如表1所示。

表1 羅氏分析儀和生物芯片掃描儀對血清樣本的檢測結(jié)果Tab. 1 Test results of serum samples from the Roche analyzer and biochip scanner

根據(jù)羅氏電化學發(fā)光全自動免疫分析儀和近紅外熒光標記蛋白芯片對10例樣本血清的檢測結(jié)果，通過Excel軟件，以羅氏儀器的檢測結(jié)果為橫坐標，以生物芯片掃描儀的檢測結(jié)果為縱坐標作散點圖，如圖4所示。

由圖4可以看到，兩儀器對血清中的CA125、CEA、CA19-9和AFP含量的檢測結(jié)果線性相關(guān)。

圖4 羅氏分析儀和生物芯片掃描儀檢測樣本血清指標含量相關(guān)性Fig. 4 The correlation between the Roche analyzer and the biochip scanner detection of serum index levels

羅氏電化學發(fā)光全自動免疫分析儀和近紅外熒光標記蛋白芯片法檢測樣本血清4項腫瘤標志物含量的線性相關(guān)系數(shù)和線性回歸方程，如表2所示。

表2 兩儀器對樣本血清檢測結(jié)果的線性相關(guān)性Tab. 2 Linear correlation between the two instruments on the sample serum test results

由表2可知，利用生物芯片掃描儀近紅外熒光標記蛋白芯片法檢測樣本血清的結(jié)果與羅氏電化學發(fā)光全自動免疫分析儀單指標測量的結(jié)果線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.99，表明兩種檢測方法高度相關(guān)。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合近紅外熒光標記蛋白芯片的免疫反應分析原理和生物芯片掃描儀的檢測原理，實現(xiàn)了近紅外熒光標記蛋白芯片多腫瘤標志物聯(lián)合定量檢測技術(shù)。通過對10例患者血清4項腫瘤標志物的檢測，獲得多個腫瘤標志物的檢測結(jié)果，CA125、CEA、CA19-9和AFP含量的檢測結(jié)果與羅氏電化學發(fā)光法單指標檢測的結(jié)果比較，線性相關(guān)系數(shù)（R）分別為0.995、0.992、0.991、0.990，結(jié)果表明，二者具有高度相關(guān)性。因此，近紅外熒光標記蛋白芯片多腫瘤標志物聯(lián)合定量檢測技術(shù)，不僅可一次性篩查多項癌癥，而且具有通量大、操作簡單、樣本用量少、檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點，對大規(guī)模人群的檢測篩查具有重要的臨床意義。

由于腫瘤病變的復雜性，腫瘤標志物與腫瘤之間的關(guān)系并非是一一對應，而是多對多的關(guān)系[21-22]，即某一腫瘤對應多項腫瘤標志物或一項腫瘤標志物對應多個腫瘤。所以，選用特異性比較高的多個腫瘤標志物進行聯(lián)合定量檢測，通過不同腫瘤標志物的組合，可提高腫瘤篩查的特異性[23-26]。利用近紅外熒光標記蛋白芯片的優(yōu)勢定期對健康人群進行多腫瘤標志物聯(lián)合定量檢測，對腫瘤的早期篩查具有重要的現(xiàn)實意義[27-28]。

本文的近紅外熒光標記蛋白芯片已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局上海醫(yī)療器械檢測研究院的檢測，并取得相應的檢測報告；生物芯片掃描儀已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局浙江醫(yī)療器械檢測研究院的檢測，并取得相應的檢測報告，目前二者均處于臨床試驗階段。