基于生物信息技術(shù)探究藿香正氣液治療COVID-19的機制

顧昱昊,陳可點,戚 蕊,盧明軍,皮雯敏,謝以清,高 豐,戴子琦,吳倩文,霍 蘇,徐 意,徐 冰*,雷海民*

1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100102;2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司,北京 100062

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19,COVID-19）屬于中醫(yī)學“疫病”的范疇,多數(shù)學者認為其病位在肺和脾[1-2]。藿香正氣方出自《太平惠民和劑局方》,涉及蒼術(shù)、陳皮、厚樸、白芷、茯苓、大腹皮、半夏、甘草、廣藿香、紫蘇和生姜11味中藥,具有解表化濕、理氣和中的功效。針對COVID-19 患者常伴隨消化道癥狀的情況[3],藿香正氣水作為《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中推薦的中成藥,其治療機制引起研究者的關(guān)注[4-6]。

基于三維整體觀探究中藥多成分、多靶點、多通路協(xié)作機制的生物信息技術(shù),具有降低藥物研發(fā)成本、指導臨床精準用藥的獨特優(yōu)勢[7-11]。本研究采用生物信息技術(shù)構(gòu)建藿香正氣液的可視化網(wǎng)絡(luò),解析藿香正氣液在治療COVID-19 方面的活性成分、作用靶標、生物學機制,以期闡明其治療COVID-19的效應機制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫信息Tab.1 Database information

1.2 篩選藥效物質(zhì)基準

登錄TCMSP,以DL≥0.18、OB≥30%為標準篩選11味藥材的有效成分,進入Sym Map數(shù)據(jù)庫核對并導出歸經(jīng)信息。

1.3 潛在靶點的預測與篩選

將篩選出的藥材有效成分輸入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫和Swiss Target數(shù)據(jù)庫,獲得相應靶點信息,并應用Uniprot數(shù)據(jù)庫對其進行標準化處理。將經(jīng)標準化處理的數(shù)據(jù)與從Genecards數(shù)據(jù)庫篩選出的COVID-19靶點基因進行映射。

1.4 構(gòu)建多水平網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

1.4.1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將映射所得的靶點基因輸入STRING 數(shù)據(jù)庫,設(shè)定物種,簡化游離蛋白,規(guī)定相互作用評分為0.9,形成關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.4.2 網(wǎng)絡(luò)建模 將歸經(jīng)-中藥-化合物-靶點-疾病的關(guān)系在Cytoscape 3.7.1信息處理的基礎(chǔ)上以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)。

1.5 通路闡述

在DAVID 數(shù)據(jù)庫中分析靶點所處通路,得出篩選結(jié)果。

1.6 分子對接

在RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫中選取最高分辨率的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）蛋白結(jié)構(gòu),用Pymol軟件進行預處理;運行AutoDock Tolls 4.2.6 為受體分子加極性氫。將小分子以“mol2”格式導入AutoDock Tolls 4.2.6并導出PDBQT 文件,經(jīng)過處理的小分子與靶點在AutoDock 4.2.6通過計算晶格能量完成分子對接。

2 結(jié)果

2.1 物質(zhì)基準的篩選

經(jīng)TCMSP平臺初步篩選,獲得關(guān)鍵化合物164種。

2.2 潛在治療靶點基因的預測

將從TCMSP平臺所得的信息以“mol2”的格式導 入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、Swiss Target數(shù)據(jù)庫,獲得3 359個靶標信息,經(jīng)去除重復,剩余443個關(guān)鍵化合物靶標信息組成數(shù)據(jù)庫,用Uniprot進行基因名稱的標準化核對與校準。在Genecards數(shù)據(jù)庫輸入“COVID-19”,獲得基因192個,將藿香正氣液與COVID-19 的靶點基因進行映射,得到潛在治療靶點67個。結(jié)果見表2。

表2 藿香正氣液-COVID-19的潛在治療靶點基因Tab.2 Potential therapeutic target genes of HXZQ-COVID-19

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將潛在治療靶點導入STRING 平臺,研究物種選擇“人類”,篩選評分＞0.9的蛋白關(guān)系,獲得關(guān)鍵靶點。結(jié)果見圖1。

圖1 藿香正氣液治療COVID-19的重要靶點Fig.1 Core targets of HXZQ in the treatment of COVID-19

2.4 網(wǎng)絡(luò)成像

將以上藥物活性成分、潛在治療靶點、藥物和疾病的名稱導入Cytoscape 3.7.1 軟件,繪制網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。通過cyto Hubba 基于度（degree）、緊密度（closeness）和中介性（betweenness）篩選均大于平均值（分別為14.05、91.48、343.45）且排名靠前的節(jié)點。重要節(jié)點有槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（βsitosterol）、柚皮素（naringenin）、漢黃芩素（wogonin）、山柰酚（kaempferol）、2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic和甘烏內(nèi)酯（glyuranolide）。

圖2 歸經(jīng)-中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of channel tropism-traditional Chinese medicine-composition-target-disease

2.5 通路分析

獲得173個GO 項目（P＜0.05）,涉及生物過程（biological process,BP）項目126 個,細胞組成（cellular component,CC）項目22個,分子功能（molecular function,MF）項目25 個,分別占72%、13%、15%。結(jié)果見表3、表4和表5,未滿足20條通路的功能選取其所有通路。KEGG 通路富集篩選得到114條信號通路（P＜0.05）,根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路。結(jié)果見表6。

表3 （續(xù)） 藿香正氣液潛在靶標的生物過程富集分析Tab.3 （Continued）GO pathway enrichment analysis for biological process of candidate targets of active compounds in HXZQ

表5 （續(xù)） 藿香正氣液潛在靶標的細胞組成富集分析Tab.5 （Continued）GO pathway enrichment analysis for cellular component of candidate targets of active compounds in HXZQ

表6 藿香正氣液潛在靶標的KEGG 通路富集分析Tab.6 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active compounds in HXZQ

2.6 分子對接結(jié)果

最低結(jié)合能越低,表示與小分子的結(jié)合能力越強,結(jié)果見表7。由表7可見,β-谷甾醇、甘烏內(nèi)酯與ACE2具有自發(fā)的親和力。

表7 關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵化合物的對接結(jié)果Tab.7 Docking results of key targets and key compounds

3 討論

本研究通過可視化網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出藿香正氣液中各藥物的歸經(jīng)及其治療COVID-19的7種潛在活性成分,其歸經(jīng)度值排名與疾病病位一一印證。其潛在活性成分分別為槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、漢黃芩素、山柰酚、2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic和甘烏內(nèi)酯。其中槲皮素和漢黃芩素等來源于君藥藿香和臣藥陳皮、佐藥蒼術(shù),印證了臨床上相須為用的中藥配伍原理。已有研究探索了槲皮素、β-谷甾醇治療COVID-19的機制[9-13],而2-hydroxyisoxypropyl-3-hydroxy-7-isopentene-2,3-dihydrobenzofuran-5-carboxylic、甘烏內(nèi)酯的抗病毒活性則是由本文首次報道。

通過PPI篩選發(fā)現(xiàn)MAPK1、MAPK3和Rel A 等是藿香正氣液治療COVID-19的關(guān)鍵靶點。據(jù)報道,MAPK1是COVID-19引起的嚴重肺損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,同時能夠調(diào)節(jié)炎癥因子的表達以延緩肺纖維化,控制氣管分泌物的生成[14-18]。Rel A 又稱NF-κB3,是機體發(fā)生抗病毒先天性免疫應答反應的重要信號因子,在氣道性炎癥、肺損傷等疾病中被激活并通過NF-κB/MAPK信號通路引起下游炎癥介質(zhì)的過表達[19-22]。

通過解析GO 富集分析結(jié)果可知,BP 主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應等。由于新型冠狀病毒RNA 的重組率非常高,故以RNA 聚合酶為靶點開發(fā)抗新型冠狀病毒抑制劑成為當下研究的熱點,同時這也被認為是中藥潛在的治療作用機制[23-25]。研究表明,COVID-19會伴隨劇烈的細胞因子風暴[26],細胞因子風暴引發(fā)的炎癥反應進一步造成嚴重的二次損傷。

解析KEGG 分析結(jié)果可知,缺氧誘導因子-1信號通路、鞘脂信號通路和腫瘤壞死因子信號通路等與藿香正氣液對COVID-19 治療作用的相關(guān)度較高。缺氧是COVID-19 患者常見的臨床表現(xiàn),調(diào)控缺氧誘導因子-1 信號通路中的HIF-1 能夠通過調(diào)節(jié)免疫、促進炎癥反應、誘導新生血管形成及生長等,引發(fā)氣道炎癥和氣道重塑[27]。鞘脂信號通路與肺纖維化的發(fā)生息息相關(guān)[28],其中S1P 還參與誘導氣道重塑和氣道平滑肌收縮[29]。腫瘤壞死因子信號通路中的TNF-α能夠通過下調(diào)MAPK、ERK 和NF-κB 等,從而抑制細胞凋亡,減輕肺部炎癥反應[30-31]。

分子對接結(jié)果顯示,所有關(guān)鍵化合物與ACE2、MAPK1和MAPK3的結(jié)合能均小于-5.0 kJ·mol-1,此外存在于半夏、生姜、白芷、紫蘇中的β-谷甾醇與存在于甘草中的甘烏內(nèi)酯,不僅能與COVID-19入侵人體的關(guān)鍵靶點ACE2 結(jié)合形成穩(wěn)定構(gòu)象,此外還與COVID-19 所致肺損傷的關(guān)鍵靶點 MAPK1 和MAPK3具有最強的親和力。

由于受限于數(shù)據(jù)庫信息差異性等問題,該研究的結(jié)果不可避免地存在一定偏差,該研究的結(jié)果將為后期的實驗研究提供參考。