白藜蘆醇調(diào)控線(xiàn)粒體通路誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡

于 瑞,汪佳穎,陶德韜,王維康,黃 瑞,李先振,周靜萍

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院,安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 口腔頜面外科,安徽 蕪湖 241001)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部一種較常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。目前OSCC標(biāo)準(zhǔn)化的治療是手術(shù)切除以及隨后輔助放化療。其中手術(shù)治療會(huì)造成頜面部較大面積的缺損,從而導(dǎo)致患者身體和心理上遭受較大的傷害；也有很多患者由于化療藥物的副作用以及耐藥性，而放棄治療或最終治療失敗[2]。所以，尋找出新的低毒高效的抗癌劑和化療增敏藥物是改善OSCC預(yù)后的關(guān)鍵。

白藜蘆醇是一類(lèi)天然的多酚類(lèi)物質(zhì)，其具有廣泛的藥理作用和良好的生物學(xué)活性，可以調(diào)節(jié)代謝，保護(hù)心血管，抗炎和抗腫瘤等[3]。有研究提到其能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)及活化線(xiàn)粒體等途徑，誘導(dǎo)胃癌、肝癌和卵巢癌等腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4-6]。但白藜蘆醇對(duì)OSCC的相關(guān)研究報(bào)告較少，是否能作為一種天然的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑應(yīng)用于OSCC，目前尚無(wú)明確的機(jī)制研究。本研究采用HN4、Cal27、HN6 3種細(xì)胞株作為研究對(duì)象，觀察白藜蘆醇對(duì)OSCC細(xì)胞凋亡的影響，探索線(xiàn)粒體通路在OSCC細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中起到的作用，為OSCC臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人OSCC細(xì)胞HN4、Cal27、HN6(ATCC公司)；DMEM-F12培養(yǎng)基、DMEM、胰酶及胎牛血清(美國(guó)GIBCO)；白藜蘆醇、線(xiàn)粒體分離試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、β-actin鼠抗(上海碧云天)；Bax、Bcl-2、caspase3、cytochrome C兔抗(武漢ABclonal)；MTT試劑盒、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(凱基生物)；Real Master Mix RT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HN4、Cal27在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HN6在DMEM-F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。CO2恒溫培養(yǎng)箱保持37℃左右，細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底90%左右進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞處理 細(xì)胞貼壁后，分成對(duì)照組和處理組。對(duì)照組：未作任何處理的3種細(xì)胞；處理組：不同濃度梯度的白藜蘆醇處理3種細(xì)胞。

1.2.3 MTT法測(cè)定OSCC細(xì)胞的活力 細(xì)胞按1x104個(gè)/孔均勻鋪在96孔板中，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定白藜蘆醇的作用濃度梯度。不同濃度梯度(25、50、100、200、400μmol/L)的白藜蘆醇處理96孔板24、48 h，設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零組，每組6個(gè)復(fù)孔。每孔加入50 μL 1×MTT至藍(lán)色結(jié)晶出現(xiàn)后，使用150 μL DMSO充分溶解藍(lán)色結(jié)晶。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm測(cè)定各孔的吸光值(即OD值)。細(xì)胞活力計(jì)算：細(xì)胞存活率=[(處理組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。本次實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3種細(xì)胞分別鋪在6孔板上，細(xì)胞貼壁后處理組中分別加入50、100、200 μmol/L白藜蘆醇處理48 h，設(shè)置對(duì)照組(對(duì)照組不作處理)。細(xì)胞裂解液和PMSF提取細(xì)胞的總蛋白和胞漿蛋白，胞漿蛋白提取時(shí)需加入線(xiàn)粒體分離試劑。采用BCA試劑盒測(cè)量濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，通過(guò)濕法轉(zhuǎn)印到NC膜上；脫脂牛奶封閉1 h，后放入一抗Bax、Bcl-2、Cyt-c、caspase3、cleared-caspase3中4℃搖床過(guò)夜，β-actin為內(nèi)參對(duì)照；二抗孵育1.5 h后用化學(xué)發(fā)光分析儀曝光，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 細(xì)胞處理同Western blot處理組，β-actin內(nèi)參對(duì)照，目的基因引物序列由上海生工設(shè)計(jì)(表1)，Trizol法提取總RNA，按照Real Master Mix RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)液的配制，逆轉(zhuǎn)錄后使用7500ABI real-time PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-PCR所需引物序列

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇降低了OSCC細(xì)胞的存活率 不同濃度白藜蘆醇處理24、48 h后，OSCC細(xì)胞數(shù)目明顯減少，密度降低(圖1)。酶標(biāo)儀讀取OD值后計(jì)算細(xì)胞活力。在25、50、100、200、400 μmol/L白藜蘆醇分別處理3種細(xì)胞24、48 h后(表2)，3種細(xì)胞活力在50～400 μmol/L濃度上均低于0 μmol/L濃度(P<0.05)；在50～400 μmol/L濃度處理48 h后，3種細(xì)胞活力均低于24 h(P<0.05)。

2.2 Western blot法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的影響

2.2.1 白藜蘆醇處理后 Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)量變化見(jiàn)圖2、表3，與對(duì)照組0 μmol/L相比，在100和200 μmol/L濃度作用HN4、Cal27細(xì)胞時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)；在HN6細(xì)胞中，50～200 μmol/L濃度時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。而在50～200 μmol/L濃度處理HN4、HN6細(xì)胞時(shí)，Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)；在Cal27中，100和200 μmol/L濃度時(shí)Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明白藜蘆醇促凋亡過(guò)程中調(diào)控了Bcl-2、Bax的變化。

2.2.2 經(jīng)白藜蘆醇處理后，與對(duì)照組0 μmol/L相比(圖3、表4)，不同濃度處理3種細(xì)胞總蛋白中cyt-c的表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化(P>0.05)，接著提取3種細(xì)胞的胞漿蛋白，發(fā)現(xiàn)50～200 μmol/L濃度時(shí)胞漿蛋白內(nèi)的cyt-c表達(dá)量高于對(duì)照組；且隨著處理濃度的增加，cyt-c表達(dá)量也在逐漸上升(P<0.05)。白藜蘆醇的促凋亡作用可能與cyt-c釋放到胞漿內(nèi)的過(guò)程密切相關(guān)。

2.2.3 與對(duì)照組0 μmol/L相比(圖4、表5)，隨著白藜蘆醇處理濃度的增加，50～200 μmol/L濃度時(shí)HN4、Cal27細(xì)胞內(nèi)的caspase3表達(dá)并未出現(xiàn)變化(P>0.05)；HN6細(xì)胞內(nèi)的caspase3表達(dá)在200 μmol/L時(shí)略有下降(P<0.05)，而3種細(xì)胞cleaved-caspase3的表達(dá)在100和200 μmol/L時(shí)均高于對(duì)照組(P<0.05)。因此，可以說(shuō)明在白藜蘆醇的作用下OSCC中的caspase3被活化。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)白藜蘆醇處理后相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 不同濃度的白藜蘆醇處理細(xì)胞48 h后，RT-PCR檢測(cè)Bax、Bcl-2及cyt-c mRNA的表達(dá)量變化，與對(duì)照組0 μmol/L相比(表6)，3種細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)在100和200 μmol/L時(shí)均低于對(duì)照組(P<0.05)，在100、200 μmol/L濃度作用HN4、Cal27細(xì)胞時(shí)，Bax、cyt-c mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)；在200 μmol/L濃度處理HN6時(shí),Bax、cyt-c mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax來(lái)參與OSCC的凋亡過(guò)程，且其促凋亡的過(guò)程與cyt-c釋放的過(guò)程有關(guān)。

圖1 白藜蘆醇對(duì)HN4、Cal27、HN6細(xì)胞數(shù)目的影響(×1，00)

圖2 Western blot檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)3種細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的影響

表2 白藜蘆醇對(duì)HN4、Cal27、HN6細(xì)胞活力的影響(n=3,%)

表3 白藜蘆醇對(duì)3種細(xì)胞處理后Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)量變化(Gene/β-actin，n=3)

圖3 Western blot檢測(cè)白藜蘆醇作用后3種細(xì)胞中cyt-c蛋白表達(dá)量變化

圖4 Western blot檢測(cè)白藜蘆醇作用后3種細(xì)胞中caspase3及cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)量變化

表4 白藜蘆醇對(duì)3種細(xì)胞處理后cyt-c蛋白表達(dá)量變化(Gene/β-actin，n=3)

表5 白藜蘆醇對(duì)3種細(xì)胞處理后caspase3蛋白表達(dá)量變化(Gene/β-actin，n=3)

表6 白藜蘆醇處理后3種細(xì)胞Bcl-2、Bax及cyt-c mRNA表達(dá)量變化(Gene/β-actin，n=3)

3 討論

白藜蘆醇作為天然抗氧化劑，多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力能夠被其抑制[3]，其抗腫瘤作用引起了廣泛的關(guān)注。本研究中我們通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)，在25、50、100、200、400 μmol/L白藜蘆醇處理OSCC細(xì)胞后，對(duì)OSCC細(xì)胞存活率的影響呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴(lài)性。這提示了我們白藜蘆醇可以明顯抑制人OSCC細(xì)胞的細(xì)胞活力，對(duì)OSCC細(xì)胞可能有促進(jìn)凋亡的作用。但由于25 μmol/L白藜蘆醇作用于OSCC細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在作用濃度400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率較低，不具有實(shí)驗(yàn)意義，故選用濃度梯度為50、100、200 μmol/L白藜蘆醇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞凋亡過(guò)程的啟動(dòng)由細(xì)胞內(nèi)一系列基因交叉控制。在線(xiàn)粒體凋亡通路中，Bcl-2家族起到了較為重要的作用[7]。Bcl-2是家族中主要的抗凋亡蛋白，其同源基因Bax可以與其形成異源二聚體Bcl-2/Bax來(lái)抑制凋亡，也可以自身形成同源二聚體Bax/Bax來(lái)促進(jìn)凋亡發(fā)生，兩者均廣泛存在于線(xiàn)粒體中[8]。所以，在線(xiàn)粒體凋亡通路中，Bcl-2/Bax的比例決定著線(xiàn)粒體外膜通路開(kāi)放的程度，是調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程的“閥門(mén)”[9]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，伴隨著白藜蘆醇誘導(dǎo)濃度的上升變化，Bcl-2逐漸減少，Bax逐漸升高。這一結(jié)果提示，白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax的變化，形成大量Bax/Bax來(lái)促進(jìn)OSCC發(fā)生凋亡，這一過(guò)程可能有線(xiàn)粒體的參與。

線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞能量代謝的中心，功能異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。在線(xiàn)粒體凋亡通路中cytochrome C釋放入胞質(zhì)，是線(xiàn)粒體通路激活的標(biāo)志[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理后，細(xì)胞總蛋白中cyt-c表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，而胞漿蛋白中cyt-c的表達(dá)隨白藜蘆醇濃度的增加而上升。cytochrome C釋放后可以與Apaf-1、Pro-caspase9合成凋亡小體，最終激活caspase3。而caspase3活化是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最后一步[12]，其可以通過(guò)分解DNA修復(fù)酶、激活核酸內(nèi)切酶來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)caspase3的表達(dá)沒(méi)有明顯變化或略微下降，而cleaved-caspase3則隨作用濃度增加而上升。有報(bào)道顯示Bax可以增加線(xiàn)粒體通透性，激活線(xiàn)粒體通路促進(jìn)凋亡發(fā)生[7]；而B(niǎo)cl-2可以通過(guò)穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位，阻止cytochrome C釋放到胞漿內(nèi)，來(lái)發(fā)揮抗凋亡的作用[8]。這提示我們，白藜蘆醇作用后可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax的表達(dá)，活化線(xiàn)粒體通路，使cyt-c向胞漿內(nèi)釋放激活caspase3，最終促使OSCC細(xì)胞發(fā)生凋亡。除此以外，在凋亡發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)外Ca2+交換、活性氧水平的改變和線(xiàn)粒體膜通透性的改變等都有可能會(huì)影響cyt-c的釋放[14-15]，以上這些仍待我們進(jìn)一步的探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明白藜蘆醇可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2因子來(lái)激活線(xiàn)粒體通路，使cyt-c向胞漿內(nèi)釋放激活caspase3，最后誘導(dǎo)OSCC發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，然而，本研究?jī)H是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)而得出的結(jié)論，對(duì)于白藜蘆醇在臨床上的應(yīng)用仍需進(jìn)一步探究。OSCC細(xì)胞凋亡的過(guò)程是由多種因素調(diào)控的，除線(xiàn)粒體通路外，可能還存在與其他途徑之間的相互關(guān)聯(lián)，這也需要我們通過(guò)更進(jìn)一步的研究來(lái)探討。