創(chuàng)傷性膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨下骨的影像學(xué)結(jié)構(gòu)改變

張文凱，黨曉謙

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科 710004；2.陜西省咸陽市中心醫(yī)院骨三科 712099)

隨著社會不斷的發(fā)展和人口老齡化的逐步加重，骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthrtis,OA)的發(fā)病率也在逐年增加，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)中國OA的總患病率約為15%，因此相關(guān)學(xué)者也越來越重視OA的相關(guān)研究[1-5]。創(chuàng)傷性O(shè)A以外傷引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變?yōu)樘攸c(diǎn)，盡管創(chuàng)傷性O(shè)A可從各種事故或受傷中發(fā)展而來，但普遍見于前交叉韌帶(ACL)和半月板撕裂的運(yùn)動損傷[6-10]。RADIN等[11]發(fā)現(xiàn)OA的軟骨退行性改變和進(jìn)展中，軟骨下骨也發(fā)揮著某種作用，認(rèn)為軟骨下骨骨量和厚度的變化改變了其生物力學(xué)特性，由此引起或加重軟骨結(jié)構(gòu)的改變。軟骨下骨改變是OA的重要因素，這種改變可促使軟骨退變，但軟骨下骨的這些改變是否為OA形成的啟動因素至今尚未證實(shí)。因此，本研究擬通過動物模型觀察創(chuàng)傷性膝OA和閉合損傷性膝OA中軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變，探討軟骨下骨的改變是OA疾病的原因還是結(jié)果，是疾病適應(yīng)環(huán)境的改變還是疾病本身的病理過程，以期能更好地指導(dǎo)臨床研究和治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

36只10月齡清潔級巨型花明兔(雌雄各半)，體重(2 500±500)g。所有動物均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心提供，檢疫均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2017-004。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉注射粉劑(上海試劑二廠)；鹽酸利多卡因注射液(上海朝暉藥業(yè)有限公司)；普通石膏(廈門鷺燕醫(yī)療器械有限公司)；DR數(shù)字化X射線光片機(jī)器(南京利昂醫(yī)療設(shè)備制造有限公司)；西門子3.0T超導(dǎo)型磁共振成像(MRI)系統(tǒng)(德國Siemens公司)；Explore Locus SP型Micro-CT(美國GE公司)。

1.3 分組及造模

采用抽簽方法將36只巨型花明兔隨機(jī)分為3組：空白組、創(chuàng)傷組、閉合損傷組，每組12只。除空白組不做任何處理進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)外，其余各組按相應(yīng)造模方法進(jìn)行造模。創(chuàng)傷性膝OA模型：取12只巨型花明兔稱重，耳緣靜脈周圍區(qū)域進(jìn)行備皮，消毒，注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行全身麻醉，麻醉滿意后將兔置于兔架上采用俯臥位固定四肢及頭部，雙側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、鋪無菌巾，術(shù)區(qū)皮下注射2%利多卡因5 mL進(jìn)行輔助麻醉。定位膝關(guān)節(jié)間隙，以膝關(guān)節(jié)間隙為中心稍偏內(nèi)側(cè)做一長約4 cm縱行切口，從皮下到關(guān)節(jié)囊逐層切開，避免損傷膝關(guān)節(jié)周圍神經(jīng)及血管，顯露內(nèi)側(cè)半月板，用尖刀予以摘除，再找到前交叉韌帶予以橫斷。再次行前抽屜試驗(yàn)確認(rèn)前交叉韌帶失效(注意動作輕巧，避免破壞關(guān)節(jié)軟骨面)后用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗術(shù)野，徹底止血后逐層縫合切口，無菌紗布包扎傷口。采用相同的方法對對側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行造模。術(shù)畢于臀部肌肉注射頭孢唑啉鈉預(yù)防感染，麻醉蘇醒后將兔放歸飼養(yǎng)籠內(nèi)(1兔1籠)，籠上貼上標(biāo)有該兔基本信息的標(biāo)簽，定期觀察術(shù)區(qū)，如有異常及時處理。閉合性損傷膝OA模型：取12只巨型花明兔稱重后按上述方法麻醉及固定，雙后肢伸直位，從踝上2 cm處到髖關(guān)節(jié)下4 cm纏繞2層棉紙，將高分子石膏用涼水浸泡后，內(nèi)層抹平，呈疊瓦狀纏繞于棉紙上，纏繞6層，邊纏繞邊抹平邊澆少量涼水在石膏上，然后在石膏外側(cè)貼附小鋁板1塊(與石膏等長)加強(qiáng)石膏的固定作用，接著再用石膏纏繞6層包裹鋁板。石膏塑形成功且麻醉蘇醒后把兔放歸飼養(yǎng)籠內(nèi)(1兔1籠)，同時定期觀察兔的基本狀況和石膏的固定情況，若有石膏脫落或石膏位置不佳時及時修復(fù)處理，并做好記錄。

1.4 檢查及標(biāo)本取材

1.4.1X線片和MRI檢查

在造模后12周，將所有動物送往西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市紅十字會醫(yī)院放射科和核磁共振室進(jìn)行雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)的正側(cè)位X線片檢查和雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)冠狀位及矢狀位MRI掃描，采集相應(yīng)圖像并進(jìn)行對比分析。

1.4.2Micro-CT檢查

完成X線片和MRI檢查后，于耳緣靜脈快速推注空氣約40 mL，空氣栓塞法處死兔，觸摸其心臟確認(rèn)無脈搏后立即解剖雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)，暴露膝關(guān)節(jié)腔，剝離軟組織，用鋸片截取完整的股骨髁和脛骨平臺(厚度約為1.0～1.5 cm)，將標(biāo)本置于專用Micro-CT掃描儀的標(biāo)本杯中并用4%多聚甲醛固定，固定24 h后送至空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所進(jìn)行Micro-CT掃描。Micro-CT掃描參數(shù)：掃描分辨率14 μm，旋轉(zhuǎn)角度360°，旋轉(zhuǎn)角度增量0.4°，電壓80 kV，電流80 μA，曝光時間2 960 ms，帕平均數(shù)4，像素組合1×1。圖像參數(shù)：圖像原始尺寸16.897 mm×13.442 mm×6.474 mm，圖像分辨率29 μm，圖像位數(shù)16位。掃描完成后導(dǎo)出圖像數(shù)據(jù)并用Reconstructiong Utility軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像重建，保存圖像，導(dǎo)入MicroView軟件，選取感興趣區(qū)域(region of interest,ROI)進(jìn)行三維重建和觀察，同時截取靜態(tài)三維圖像，應(yīng)用高級骨形態(tài)分析(Advanced Bone Analysis)軟件對ROI進(jìn)行骨顯微參數(shù)測試和分析。ROI軟骨下骨骨小梁分析參數(shù)：骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb·Th)，即骨小梁的平均厚度；骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction,BVF)，即骨小梁的體積除以標(biāo)本的體積；骨小梁數(shù)量(trebecular number,Tb·n)，即骨組織與非骨組織的交點(diǎn)數(shù)量；骨小梁間隙(trabecular spacing,Tb·Sp)，即骨小梁之間的髓腔平均寬度；組織骨密度(tissue bone mineral density,tBMD)，即當(dāng)前ROI內(nèi)部被閾值二值化認(rèn)定為骨骼部分的骨密度，不包括非骨骼部分的體素；體積骨密度(volumetric BMD,vBMD)，即為多孔骨小梁結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)密度，反映ROI內(nèi)的總體骨礦鹽密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 X線片檢查結(jié)果

X線片檢查結(jié)果顯示空白組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨無明顯改變；創(chuàng)傷組膝關(guān)節(jié)周圍有大量骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨下有明顯的高密度影，關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)與外側(cè)間隙不對等，內(nèi)側(cè)間隙明顯小于外側(cè)，關(guān)節(jié)面毛躁不平，呈明顯OA改變；閉合損傷組膝關(guān)節(jié)周圍可見少量骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨下有稍高密度影，且范圍局限，關(guān)節(jié)間隙稍有狹窄，關(guān)節(jié)面毛躁表現(xiàn)較輕。見圖1。

2.2 MRI掃描結(jié)果

MRI掃描結(jié)果顯示空白組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨無明顯病理改變；創(chuàng)傷組膝關(guān)節(jié)MRI掃描可見大部分軟骨缺失，深達(dá)骨質(zhì)全層，可見軟骨下骨骨質(zhì)異常，殘留軟骨信號強(qiáng)度降低，其軟骨下骨為高信號影；閉合損傷組膝關(guān)節(jié)MRI掃描顯示關(guān)節(jié)軟骨呈低信號影，軟骨表面欠規(guī)整，局部有凹陷，關(guān)節(jié)軟骨損傷達(dá)到軟骨下骨。見圖2。

A:空白組；B:創(chuàng)傷組；C:閉合損傷組。

2.3 Micro-CT檢查結(jié)果

2.3.1Micro-CT三維重建

空白組膝關(guān)節(jié)軟骨下骨無明顯骨贅形成，軟骨下骨骨小梁排列整齊有序，未見明顯斷裂；創(chuàng)傷組膝關(guān)節(jié)邊緣可見大量骨贅形成，軟骨下骨骨小梁稀疏斷裂、扭曲；閉合損傷組膝關(guān)節(jié)周圍骨贅形成較少，軟骨下骨骨小梁少量斷裂。見圖3。

2.3.2軟骨下骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)

空白組軟骨下骨顯微結(jié)構(gòu)變化不大；創(chuàng)傷組和閉合損傷組與空白組比較，股骨遠(yuǎn)端內(nèi)側(cè)、脛骨近端內(nèi)側(cè)軟骨下骨顯微參數(shù)變化顯著，BVF、Tb·Th和Tb·n均明顯降低，Tb·Sp、tBMD、vBMD明顯增高，且創(chuàng)傷組改變更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 股骨遠(yuǎn)端內(nèi)側(cè)軟骨下骨骨微結(jié)構(gòu)顯微參數(shù)

A:空白組；B:創(chuàng)傷組；C:閉合損傷組。

A:空白組；B:創(chuàng)傷組；C:閉合損傷組。

表2 脛骨近端內(nèi)側(cè)軟骨下骨骨微結(jié)構(gòu)顯微參數(shù)

3 討 論

OA是以關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨退變，周圍骨贅形成為特點(diǎn)的一類骨關(guān)節(jié)疾病[12-16]。早期的OA患者有輕微的疼痛或無明顯癥狀，而中晚期患者的疼痛明顯加劇，甚至伴有活動受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[17-20]。OA根據(jù)其致病原因大致分為原發(fā)性O(shè)A和繼發(fā)性O(shè)A；前者病因尚不明確，可能與年齡、肥胖、性別、長期負(fù)重、屈膝工作等有關(guān)；而繼發(fā)性O(shè)A多見于創(chuàng)傷，也稱創(chuàng)傷性O(shè)A，常見于扭傷致韌帶或半月板損傷、關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、各種原因所致的關(guān)節(jié)內(nèi)感染等[21-23]。雖然諸多研究使OA的概念、致病原因、病理病機(jī)、危險(xiǎn)因子、臨床治療手段都在持續(xù)的革新和進(jìn)步，但至今對其致病原因和病理生理機(jī)制仍未達(dá)成共識[24-26]。不可否認(rèn)的是這些研究對OA的基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)行了開拓，同時對臨床治療也有很大幫助，但至今仍無法找到藥物或者措施來根治OA，此外對于OA的早期診斷和預(yù)防其惡化的方法目前也是十分有限。因此，探索OA發(fā)生發(fā)展過程中軟骨下骨的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將有助于揭開OA的神秘面紗，為其預(yù)防、早期診斷、改善治療開拓新的思路和方法。

有研究表明軟骨下骨的病變可在軟骨退行性改變之前，可直接驅(qū)使OA的形成或加速OA的發(fā)生與發(fā)展以致形成OA[27-29]。王永成等[30]認(rèn)為在骨軟骨缺損的自然發(fā)展歷程和修復(fù)治療中應(yīng)當(dāng)重視軟骨下骨的臨床重要性，需要更長時間觀察和評價其機(jī)械生物力學(xué)性能。軟骨下骨的骨重建過程不是一個簡單的繼發(fā)性事件，應(yīng)該是與軟骨發(fā)生的退行性改變緊密關(guān)聯(lián)，在OA的驅(qū)使和進(jìn)展過程中，鈣化層骨化中心的再次活躍和軟骨下骨骨轉(zhuǎn)換率的增強(qiáng)發(fā)揮著重要的作用，軟骨和軟骨下骨以鈣化層為媒介，相互作用，導(dǎo)致惡性循環(huán)[31]。本研究采用了創(chuàng)傷性膝OA和閉合損傷性膝OA兔模型，觀察OA中軟骨下骨在X線片、MRI、Micro-CT中的改變，通過模型間的橫向?qū)Ρ?，可以探究?chuàng)傷和閉合損傷對于OA的形成和發(fā)展的影響。研究結(jié)果表明不管是創(chuàng)傷還是閉合損傷形成的OA中，均有軟骨下骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，且創(chuàng)傷造成的病變較閉合損傷更為嚴(yán)重，這不僅體現(xiàn)在宏觀的X線片和MRI上，還體現(xiàn)在相對微觀的Micro-CT顯微參數(shù)中；在Micro-CT中，創(chuàng)傷性膝OA模型中膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨小梁結(jié)構(gòu)變化最明顯，BVF、Tb·Th、Tb·n較正常和閉合損傷性O(shè)A模型均明顯降低，而Tb·Sp、tBMD、vBMD明顯增高。因此，軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變對于OA的治療有著重要意義。