枯草芽胞桿菌高細胞密度發(fā)酵優(yōu)化

戴 航， 丁 躍， 陳 雄， 王 志

(1 湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2 湖北工業(yè)大學工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430068；3 湖北工業(yè)大學工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068)

益生菌是一類定植于動物腸道、能夠對宿主產(chǎn)生健康功效的有益活性微生物，其作用機制大致分為四類：增強腸道黏膜屏障功能[1]、阻止病原菌的黏附[2]和定植[3]、增強系統(tǒng)的免疫反應[4]、分泌物質[5]和改變腸道環(huán)境[6]。枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)發(fā)酵能夠產(chǎn)α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶等十幾種酶[7]，是被允許作為動物飼料添加劑的益生菌菌種[8-10]。因其芽胞具有極強的抗逆性，常被加工成芽胞菌粉以便運輸和保存。采用高密度發(fā)酵技術大規(guī)模培養(yǎng)非遺傳修飾菌是枯草芽胞桿菌工業(yè)生產(chǎn)的常用方式，而達到高密度發(fā)酵的一般標準是芽胞數(shù)達到200億個/mL的水平。

微生物生長繁殖過程復雜，受到內外部條件共同影響[11-14]。培養(yǎng)基作為微生物生長代謝的營養(yǎng)基質，其組成成分和比例對細胞生長存在很大影響。趙達等[15]通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，確定在3%玉米淀粉、6%豆粕等培養(yǎng)物下，發(fā)酵60～66 h，B.subtilisB03生物量達到105.7×108CFU/mL；陳俊煌[16]優(yōu)化B.subtilisHS-09發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，使用復合氮源能顯著提高菌落總數(shù)，在最適發(fā)酵培養(yǎng)基下用200 L發(fā)酵罐放大試驗，有效活菌數(shù)達4.3×109CFU/mL，芽胞率90%；朱曉立等[17]研究了B.subtilisB53在前期碳限制條件下(0.4%玉米淀粉、0.2%葡萄糖)結合流加葡萄糖的補料策略，30 L罐培養(yǎng)26 h，芽胞數(shù)最高能達到110億個/mL。

在枯草芽胞桿菌工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳氮源是主要的組成部分，其中玉米淀粉、豆粕和蛋白胨的價格是影響發(fā)酵成本的主要因素。通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化確定其比例對菌體生長效率的影響尤為重要。而發(fā)酵溫度不僅影響酶活性，還影響發(fā)酵液的物理特性，從而對菌體產(chǎn)生影響[18]。Hecker等[19]發(fā)現(xiàn)熱激能夠誘導RelA蛋白的合成，促發(fā)嚴謹反應。而芽胞生成本身就是細胞對逆境應激的策略之一[20]。因此適宜的碳氮比和發(fā)酵條件以及一定的逆境條件可能會促進芽胞的生成。

基于以上分析，本研究首先在30 L罐上采用分批發(fā)酵方式探討不同發(fā)酵策略對枯草芽胞桿菌生長的影響，確立了一種有效的發(fā)酵方法，為枯草芽胞桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽胞桿菌HT-03(BacillussubtilisHT-03,HT-03菌株)，由發(fā)酵工程教育部重點實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸膏20 g/L，瓊脂20 g/L，NaCl 5 g/L,調pH 7.5±0.1，123℃滅菌30 min；活菌數(shù)測定(平板計數(shù))培養(yǎng)基同上。

30 L罐基礎(對照)培養(yǎng)基配方為搖瓶正交實驗優(yōu)化后所得配方(g/L)：玉米淀粉30，豆粕60，葡萄糖5，酵母浸粉3，蛋白胨3，輕質碳酸鈣3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 2，K2HPO4·3H2O 2，MnSO4·H2O 0.3。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1種子活化從-80 ℃冰箱的甘油管轉接試管斜面，37℃培養(yǎng)36 h。

1.3.2種子制備向新鮮試管斜面加入無菌水，制備菌懸液，后80℃水浴10 min，備用接種，接種量為10 mL，菌體濃度為20×108CFU/mL。

1.3.3 30L罐分批發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵體積按罐容積的60%(18 L)計，121℃，滅菌30 min。

發(fā)酵條件：恒溫35℃，起始轉速500 r/min，通風量1.0 m3/h，發(fā)酵8 h轉速和通風量調至800 r/min、2.5 m3/h，發(fā)酵24 h轉速和通風量調至500 r/min、1.5 m3/h，發(fā)酵30 h轉速和通風量調至300 r/min、1.0 m3/h。整個發(fā)酵周期罐壓維持在0.04～0.05 MPa。

1.3.4 30L罐發(fā)酵策略如表1所示。

表1 發(fā)酵策略設計

1.4 檢測方法

1.4.1活菌數(shù)的測定發(fā)酵液活菌數(shù)(CFU/mL)采用稀釋涂布平板法[21]，每間隔3 h周期取樣檢測。

1.4.2芽胞數(shù)的測定適當稀釋的菌液經(jīng)80℃水浴15 min，后進行平板涂布。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)至少是3組平行實驗的均值，通過Origin 9.0對實驗數(shù)據(jù)進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 枯草芽胞桿菌在發(fā)酵策略1下的生長情況

在發(fā)酵策略1下細胞生長情況如圖1所示：18～24 h菌體對數(shù)生長，其平均比生長速率μ=0.062 h-1[14]，24 h生物量達到157×108CFU/mL，芽胞155億個/mL。

圖 1 枯草芽胞桿菌在發(fā)酵策略1下的生長情況

由于芽胞桿菌對數(shù)生長會發(fā)生溢流代謝而產(chǎn)酸，所以pH逐漸下降，而后菌體可以利用溢流的有機酸作碳源進行二次生長[22]，再加上基質中氨基酸的消耗，因而pH從18 h的7.99持續(xù)回升至8.78(42 h)。

18～24 h溶氧(DO)持續(xù)回升至77.9%， 此時降低轉速至500 r/min、 通風量至1.0 m3/h， DO降至最低值53.8% (30 h) 后快速上升。 30～42 h生物量略有增加，但μ僅有0.011 h-1。 雖然42 h生物量達到177×108CFU/mL， 但芽胞數(shù)(163億個/mL)較30 h(155.8億個/mL)只提高4.6%。說明：發(fā)酵后期(30 h之后)基質營養(yǎng)不足以滿足菌體生長的需求，并引起細胞耗氧大幅下降，使DO于42 h回升至86.3%。由于30 h后碳源、氮源等營養(yǎng)基質不能滿足菌體大量生長所需，所以生物量和芽胞數(shù)均不高，因此接下來可考慮調整碳氮源的比例來考察菌體的生長情況。

2.2 策略2對枯草芽胞桿菌生長的影響

在發(fā)酵條件、培養(yǎng)基其他成分不變的基礎上，僅將基料中的玉米淀粉和豆粕分別提高到4%和8%形成策略2，菌體生長代謝情況如圖2所示：

圖 2 策略2對枯草芽胞桿菌生長的影響

18～24 h生物量從210×108CFU/mL增長到274×108CFU/mL，雖然其μ為0.044 h-1，比策略1低29%(這可能是由于對數(shù)前期菌體迅速生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對后期生長有一定抑制作用)，但其24 h的生物量較策略1提高74.5%。

與策略1相似的是：pH從18 h(7.85)上升至發(fā)酵結束(8.89)，不同的是：24 h以后生物量和芽胞還在持續(xù)增加，說明：增加碳源、氮源的用量能夠延長細胞生長周期，提高生物量和芽胞數(shù)。芽胞從21 h的185億個/mL增加到30 h的312億個/mL，較發(fā)酵策略1下30 h的芽胞數(shù)提高100.3%。

18～24 h溶氧持續(xù)回升至67.5%，降低轉速和通風量后，溶氧基本維持穩(wěn)定，30 h后開始上升至發(fā)酵終點91.3%。雖然30～42 h芽胞數(shù)有所提高，但培養(yǎng)12 h只提高了4.8%，42 h后維持穩(wěn)定。因此在策略2條件下可考慮發(fā)酵終點選在第30 h。

雖然30 h芽胞數(shù)達到312億個/mL，但由于基料濃度高，導致發(fā)酵液粘度增大，不僅使成本升高，而且對發(fā)酵下游加工處理帶來較大困難。因此，考慮減少配方用料，考察菌體的生長情況。

2.3 策略3對枯草芽胞桿菌生長的影響

豆粕用量降至5%(發(fā)酵策略3)菌體生長情況如圖3所示。

圖 3 策略3對枯草芽胞桿菌生長的影響

18～33 h的生物量一直在增加，但30 h僅有119×108CFU/mL，較發(fā)酵策略2下30 h的生物量(315×108CFU/mL)減少近62%、較發(fā)酵策略1減少24%。33 h生物量達到峰值130×108CFU/mL后有略微下降。18～33 h菌體平均生長速率為6.33×108CFU·(mL·h)-1較策略2下18～30 h的平均生長速率(8.75×108CFU·(mL·h)-1)下降27.7%。18 h以后pH持續(xù)回升，但pH均低于發(fā)酵策略1和2，36 h取樣結束時的pH為7.92。

18～24 h溶氧緩慢上升，24 h降低轉速和通風量后，溶氧上升較快，這與菌體生長速率逐漸減小的趨勢保持一致。

另外，24 h之前幾乎還未形成芽胞，且30 h的芽胞數(shù)僅有94億個/mL，較策略1和2減少40%、70%。33 h芽胞數(shù)達到108億個/mL，此時芽孢率也僅有83%。相較于策略1，雖然玉米淀粉由3%增加至4%，但豆粕由6%減少至5%，生物量和芽胞數(shù)都有所下降，這可能是由于氮源對枯草芽胞桿菌后期的生長和芽胞生成影響較大。相較于策略2，由于培養(yǎng)基中豆粕減少了37.5%，所以可供菌體用于生長繁殖和形成芽胞所需的氮源大量減少，不足以維持菌體高密度發(fā)酵以及有效生成芽胞。

2.4 策略4對枯草芽胞桿菌生長的影響

既然豆粕減少至5%不能滿足高密度發(fā)酵所需的條件，那么接下來可考慮微調其他氮源的用量來考察其對菌體生長的影響。

在策略3的基礎上，將蛋白胨的用量從0.5%增加到0.8%形成策略4。菌體生長情況如圖4所示：18～36 h生物量從122×108CFU/mL持續(xù)上升至252×108CFU/mL，平均生長速率為7.22×108CFU·(mL·h)-1，36 h后有略微增加。36 h的芽胞數(shù)(198億個/mL)較策略3提高近82%，42 h芽胞數(shù)達到210億個/mL，較策略1(163億個/mL)提高29%。

圖 4 策略4對枯草芽胞桿菌生長的影響

與策略3一樣，18 h之后pH持續(xù)回升，但pH值均高于策略3，發(fā)酵終點45 h的pH為8.91。24 h調低轉速和通風量后，溶氧維持在30%左右，這可能是由于菌體還在緩慢生長，因此6 h之內耗氧和溶氧速率基本相等，二者處于動態(tài)平衡。

蛋白胨中含有豐富的蛋白質、氨基酸、生長因子和微量元素等營養(yǎng)成分。微調增加了0.3%后，菌體生長速率較策略3有明顯提高，且芽胞數(shù)高于策略3。

2.5 策略5對枯草芽胞桿菌生長的影響

將策略4中玉米淀粉和豆粕的用量從4%、 5%分別降低到3.5%、 4%形成策略5。 菌體生長情況如圖5所示：18 h的pH值為7.43與策略4相近， 但與策略4不同的是， 30 h之前回升較快， 與溶氧變化趨勢一致， 這可能是由于溢流的有機酸較少， 消耗較快， 到后期營養(yǎng)不足， 菌體生長變緩。 雖然18 h的生物量(94×108CFU/mL)只有策略4的77%， 但42 h生物量(236×108CFU/mL)較策略4只減少10%。42 h芽胞數(shù)較策略4僅減少6.7%，較策略1提高20.2%。策略4的36 h芽胞數(shù)為 198億個/mL， 而策略5發(fā)酵42 h芽胞也能達到 196億個/mL，只是發(fā)酵周期較策略4延長了6 h。因而需要考慮采用工藝參數(shù)優(yōu)化來縮短發(fā)酵周期。

圖 5 策略5對枯草芽胞桿菌生長的影響

2.6 策略6對枯草芽胞桿菌生長的影響

基于策略5，發(fā)酵24 h將溫度從35℃升至40℃形成策略6，考察一定的逆境條件對細胞生長情況的影響(圖6)：18～24 h生長情況如策略5基本一致，18 h的pH值7.37，后持續(xù)上升至發(fā)酵結束(42 h)為8.65，略微低于策略5。24 h升溫后，雖然27 h生物量只比策略5高5.2%，但此時芽胞數(shù)(82億個/mL)較策略5提高了46.4%。同時，芽胞率也比策略5提高了39%。36 h芽胞達208億個/mL，較策略5提高42.5%。發(fā)酵24 h降低轉速和通風量后溶氧依然在上升，這可能是由于菌體進入對數(shù)生長后期，胞內能量代謝水平降低，對溶氧需求逐漸下降造成。

圖 6 策略6對枯草芽胞桿菌生長的影響

以上數(shù)據(jù)表明：策略6芽胞數(shù)達到200億個/mL左右用時(36 h)比策略5減少近15%，與策略4接近，但其碳、氮源較策略4分別下降12.5%、20%，生產(chǎn)成本顯著降低。

2.7 不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響

不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響如表2所示。

升溫能促進芽胞生成效率，但對細胞生長沒有促進效果(策略6和策略5)。策略1發(fā)酵42 h生物量為177×108CFU/mL，未達到高密度最低要求。即使升溫縮短了芽胞生成周期、提高了芽胞率，仍不能達到高密度發(fā)酵水平(芽胞數(shù)200億個/mL)，因此未研究策略1下升溫處理對細胞生長代謝的影響。

策略2枯草芽胞桿菌生物量和芽胞數(shù)最高，24 h芽胞數(shù)就已達到251億個/mL，但在此條件下成本較高。策略3生物量和芽胞數(shù)最低，36 h芽胞數(shù)僅有109億個/mL。策略4發(fā)酵36 h芽胞數(shù)達到198億個/mL，將策略4中的玉米淀粉和豆粕分別降低0.5%和1%(策略5)發(fā)酵42 h芽胞數(shù)達到196億個/mL，雖然周期延長了6 h，但碳氮源分別減少了12.5%和20%，發(fā)酵成本降低。在策略5基礎上，24 h將發(fā)酵溫度從35℃升至40℃，發(fā)酵36 h芽胞數(shù)達到208億個/mL，與策略4相近。

另外，策略6發(fā)酵36 h，細胞數(shù)達217×108CFU/mL，芽胞數(shù)208億個/mL，其發(fā)酵效率相比趙達等[15]、陳俊煌[16]、朱曉立等[17]的報道顯著提高。

表2 不同策略對枯草芽胞桿菌生長的影響

3 結論

枯草芽胞桿菌高密度發(fā)酵中，培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對細胞生長和芽胞生成具有很重要的影響。本研究在已確定搖瓶水平最適發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵溫度的基礎上，進一步通過優(yōu)化發(fā)酵策略確定了30 L罐分批發(fā)酵工藝參數(shù)：玉米淀粉35 g·L-1， 豆粕40 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，酵母浸粉3 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，輕質碳酸鈣3 g·L-1，七水硫酸鎂0.5 g·L-1，氯化鈉2 g·L-1，三水磷酸氫二鉀2 g·L-1，一水硫酸錳0.3 g·L-1，發(fā)酵24 h溫度從35℃升至40℃。發(fā)酵36 h，細胞數(shù)達217×108CFU/mL，芽胞數(shù)208億個/mL，較優(yōu)化前分別提高28.4%、31.6%，實現(xiàn)了低成本培養(yǎng)基配方條件下的高芽胞率高密度發(fā)酵，為枯草芽胞桿菌工業(yè)化生產(chǎn)穩(wěn)定芽胞率提供了重要參考。

另外，細胞是否開始形成芽胞是由內外環(huán)境條件共同決定的，與調控因子Spo0A含量和其磷酸化水平有關[23]。由于枯草芽胞桿菌呼吸代謝過程存在氧化應激[24]，而氧化應激會對電子傳遞鏈造成損傷，影響細胞的能量供應效率[25-26]。進而可能會對芽胞生成效率產(chǎn)生影響，因而該領域的研究有待進一步展開。