“中風1號”對急性腦出血大鼠PI3K/Akt信號轉導通路、GSK-3β蛋白表達的影響*

梁 群 楊 洋 李 帥 潘郭海容 朱永志△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

腦出血（ICH）又稱出血性卒中，隨著年齡的增長腦出血發(fā)生的風險明顯增加，但目前50歲以下的發(fā)病率穩(wěn)定上升，占比逐漸增大，治療及預后并沒有得到明顯改善[1-2]。近期的研究多集中于出血性卒中病理機制的研究，以期為臨床治療尋找潛在的靶點，但由于其復雜性和局限性，進展一直有限[3]。

有研究顯示，神經(jīng)損害是腦出血發(fā)生后出現(xiàn)的腦水腫、氧化應激等繼發(fā)性腦損傷導致的，神經(jīng)元是患者神經(jīng)功能恢復的重要因素[4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉導通路對神經(jīng)細胞增殖、分化、抑制凋亡意義非凡，對血管新生亦十分重要[5]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它的高表達可加重神經(jīng)元的損傷，且GSK-3β的促凋亡作用此前已被證明通過PI3K/Akt信號轉導通路途徑負調控[6]?！爸酗L1號”是一種用于出血性中風急性期的中藥方劑，本研究將其應用于腦出血模型大鼠，通過觀察其對PI3K/Akt信號轉導通路、GSK-3β蛋白表達的調控，來探索中醫(yī)、中藥對出血性卒中治療的可行性，進一步探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別體質量200～240 g的SD雄性大鼠40只，購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。在自然光線的實驗室使用普通專用飼料喂養(yǎng)，溫度（22±4）℃，相對濕度40%～70%，經(jīng)過1周適應性飼養(yǎng)后進行實驗，操作過程及處死方式遵循國際通用實驗動物使用指南。

1.2 實驗藥物 中風1號，組方：水蛭10 g，澤瀉10 g，三七粉10 g，生大黃5 g，生地黃5 g，飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室。大鼠用藥灌胃量按動物體表面積比率計算[7]，水煎至每毫升含藥3.5 g（3.5 g/mL）。20%甘露醇注射液，石家莊四藥有限公司生產，規(guī)格50 mL/瓶，國藥準字H1302303。

1.3 試劑與儀器 Western blotting一抗二抗去除液（P00258 Beyotime）；完全不含EDTA的蛋白酶抑制劑（04693159001Roche）；5×Protein Loading Buffer（B130043 Biosntech）；Page ruler prestained protein ladder（26617 Thermo）；RIPALysis Buffer（P00013B Biosntech）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（BL508A Biosharp）；TrisBase（T1378 Sigm）；Glycine（NC-S0002-500納川）；Sodium dodecyl sulfate（NC-0227-500納川）；封閉專用脫脂奶粉（P1622普利萊）；Tween20（0777 Amresco）；Western HRP Substrate（NC-WBLUR0500F Millipore）；異丙醇、甲醇（西隴化工）；電泳儀（042BR13724 Bio-Rad）；低溫離心機（SORVALLST8/8R Thermo）；轉膜儀（221BR52130 Bio-Rad）；酶標儀（MULTISKANFC Thermo）。

1.4 分組與造模 將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只。分別為假手術組、模型組、中風1號組、甘露醇組，將1∶10的水合氯醛粉劑與生理鹽水混合，振搖至完全溶解，按400 mg/kg注射于大鼠腹腔，約8～10 min后，用鑷子輕夾大鼠四肢，確定大鼠進入麻醉狀態(tài)，將其俯臥固定于立體儀上，頭部毛發(fā)剃除，常規(guī)備皮，前囟抬高約1 mm，以碘伏消毒，在頭部正中割2.5 cm縱形切口，使用擴皮器牽開切口，在前囟點右側3.5 mm，再延矢狀面在后側0.2 mm處取點，牙鉆鉆孔，深及骨膜，有鏤空感即止[8]。注射器抽取大鼠尾部動脈血（血量＞70 μL）后，迅速用微量注射器抽取60 μL，并將其固定于定位儀，使微量注射器針頭垂直于顱骨圓孔，進針深約6.0 mm，將動脈血緩慢注入大鼠腦內，時間約為2 min，留針10 min以防血液倒流，緩慢退針，牙科水泥封孔，縫合手術創(chuàng)面，為防感染，于縫合處覆蓋少量青霉素鈉粉末[9]。假手術組不注入動脈血，只做開顱、鉆孔。

1.5 給藥方法 首次給藥時間為術后24 h，參考成人劑量與人體質量的折算系數(shù)比例公式來計算大鼠用藥量，且已于前期實驗研究確定用藥劑量。模型組、假手術組：生理鹽水1.5 mL灌胃，生理鹽水1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。中風1號組：中藥湯劑1.5 mL灌胃，生理鹽水1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。甘露醇組：生理鹽水1.5 mL灌胃，甘露醇1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。各組持續(xù)給藥7 d。

1.6 神經(jīng)行為學評分 于術后24 h（給藥前）、3、7 d進行神經(jīng)功能評分，采用改良版的神經(jīng)功能缺損評定標準（mNSS）[10]進行評分，分值0～18分。

1.7 Western blotting檢測 術后第8天予乙醚麻醉后，斷頭處死大鼠，取血腫區(qū)的腦組織20 mg，提取蛋白，取20～40 μg蛋白溶液RIPALysisBuffer補齊一致，加入5×Protein Loading Buffer，金屬浴100 ℃，5 min。取含20 μg蛋白的溶液上樣，電泳、轉膜、封閉，一抗、二抗，ECL顯色，置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS25統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。計量資料采用獨立樣本t檢驗（不符合正態(tài)性采用非參數(shù)檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1。術后24 h，與假手術組比較，各造模組神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.05），而模型組、中風1號組、甘露醇組分別兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明造模成功。術后3、7 d，各造模組與假手術組比較評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中風1號組、甘露醇組分別與模型組比較評分明顯降低（P＜0.05），提示中風1號能改善腦出血后大鼠的神經(jīng)功能。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別模型組假手術組中風1號組甘露醇組n 8 8 8 8術后24 h 11.6±1.5*1 11.2±1.8*10.9±1.6*術后3 d 15.7±1.8*1 13.8±1.6*△11.8±1.2*△術后7 d 15.4±1.7*1 11.6±1.9*△9.2±1.4*△

2.2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表達水平比較 見表2，圖1。與假手術組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，中風1號組、甘露醇組PI3K、Akt蛋白表達均顯著上升（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達顯著下降GSK-3β（P＜0.05）。而中風1號組與甘露醇組相比，PI3K、Akt蛋白表達有明顯差異（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

注：與中風1號組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01。

組別模型組假手術組中風1號組甘露醇組n 8 8 8 8 PI3K 0.701±0.035*1.159±0.038 0.819±0.054*△0.945±0.055*△△▲Akt 0.748±0.046*1.245±0.046 0.882±0.059*△1.028±0.072*△△▲GSK-3β 1.717±0.075*1.287±0.040 1.556±0.073*△1.480±0.079*△

圖1 各組大鼠腦組織PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表達

3 討 論

腦血管病變是腦出血發(fā)病的主要原因，在腦出血發(fā)生后，腦血腫及腦組織在破壞過程中所釋放的炎癥因子、毒性因子導致了神經(jīng)細胞的凋亡和神經(jīng)纖維的斷裂[11]。如何抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕神經(jīng)功能缺陷，成為改善臨床患者治療及預后的研究重點。腦出血發(fā)生后會釋放出神經(jīng)細胞生長因子等具有絡氨酸酶活性的物質，這種活性物質會特異性地結合PI3K的調節(jié)亞基，使PI3K下游效應分子Akt獲得催化[12]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K下游效應的主要中介，協(xié)調多種胞內信號，控制細胞對外界刺激的反應，Akt被激活后可以使下游靶向蛋白磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用[13]。有研究顯示，大腦中動脈閉塞后5 h在缺血病灶區(qū)神經(jīng)元可測到磷酸化Akt[14]，由此可見PI3K/Akt信號轉導通路在細胞新陳代謝、增殖、凋亡中起到重要的作用，和神經(jīng)功能損傷密切相關。GSK-3β是Akt信號通路下游的重要靶點，是細胞保護信號通路的會聚點，在調節(jié)神經(jīng)元極性、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性紊亂等方面有重要意義[15]，進一步激活GSK-3β的促凋亡作用，可加重神經(jīng)細胞損傷[16]，由此可見GSK-3β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性和急性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著關鍵作用[17]。越來越多的研究表明，能夠激活PI3KAkt信號轉導通路，并抑制GSK3β蛋白活性的藥物可以在腦出血發(fā)生后起到神經(jīng)保護的作用[18]。

腦出血在中醫(yī)學屬“中風-中臟腑閉證-陽閉”的范疇，基本病機為臟腑陰陽失調、氣血逆亂。逆亂的氣血上沖至腦，使神竅閉阻，血菀腦腑，髓破血溢。多由內傷積損，產生瘀血、痰火、肝風、風火，加之外邪侵襲、情志不遂、飲食不節(jié)、勞逸過度等因素誘發(fā)[19]。中醫(yī)中藥從整體出發(fā)，在腦出血的治療及預后貢獻了一定的作用，說明中醫(yī)藥在這一領域具有獨特的優(yōu)勢?！爸酗L1號”是全國名中醫(yī)藥專家傳承工作室指導教師朱永志教授多年治療急性腦出血臨床經(jīng)驗的總結，由水蛭、澤瀉、三七粉、生大黃、生地黃配伍而成，化痰祛風，以使血脈暢通、祛瘀生新、消濁祛痰，以達到標本兼治的目的[20-21]。甘露醇注射液是臨床搶救腦部疾患常用的一種降低顱內壓的高滲降壓藥，在其進入體內后能迅速提高血漿滲透壓，使組織脫水，降低顱內壓、眼內壓，經(jīng)腎小球濾過后，不易被腎小管重吸收，增加尿滲透壓，可帶出體內大量水分，減輕腦水腫，因此選作對照用藥。

本研究建立腦出血大鼠模型，觀察術后24 h、3 d、7 d神經(jīng)功能損傷評分，發(fā)現(xiàn)“中風1號”可以有效緩解大鼠腦出血后神經(jīng)功能的損害，雖與甘露醇組有一定差距，但也是具有顯著效果的。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)“中風1號”對PI3K/Akt、GSK-3β蛋白表達的有調控作用，可以有效提高PI3K、Akt的蛋白表達，降低GSK-3β的蛋白表達。因此我們假設“中風1號”可以通過激活PI3K/Akt信號通路，來抑制GSK-3β的促凋亡作用，以達到減少神經(jīng)細胞凋亡、減輕腦出血后神經(jīng)功損傷，改善預后的目的。從研究中可以看出“中風1號”在調控PI3K、Akt蛋白表達方面發(fā)揮了較為明顯的作用，但與甘露醇的調控效果還具有一定差異，可在抑制GSK-3β蛋白表達方面與甘露醇無明顯差異，究竟是什么原因使“中風1號”在調控GSK-3β蛋白表達上能力更突出，有待進一步研究。