哺乳期全氟辛烷磺酸暴露誘導(dǎo)子代青春期大鼠慢性肺損傷及其機(jī)制*

覃 珊 ， 莫佳麗 ， 張慧珊 ，2， 葉樂平 △

（1北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科，北京 100034；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心，上海 200127）

全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）是一種全氟烷基物質(zhì)（perfluoroalkyl substances，PFAS），已被證實具有生物累積作用和多系統(tǒng)多器官發(fā)育毒性。研究顯示，哺乳期母體PFOS 可通過母乳轉(zhuǎn)移至子代體內(nèi)［1］，影響子代成年期葡萄糖脂質(zhì)代謝［2］及海馬［3］和小腦［4］功能，提示哺乳期 PFOS 暴露可對子代的健康造成長期影響。我們前期研究已證實，肺對 PFOS 的暴露極其敏感［5］，宮內(nèi) PFOS 暴露可導(dǎo)致胎鼠肺基因改變［6］和新生大鼠肺組織類支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）改變［7］。然而，目前尚不清楚哺乳期PFOS 暴露是否對子代青春期大鼠的肺部造成遠(yuǎn)期影響，故本研究旨在探討哺乳期PFOS 暴露對子代青春期大鼠肺部的遠(yuǎn)期影響及其可能機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

PFOS 購自 Sigma；白細(xì)胞介素 18（interleukin-18，IL-8）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和可溶性白細(xì)胞介素2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）ELISA 試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗β-actin 抗體和抗gasdermin E（GSDME）抗體均購自Abcam；抗caspase-3抗體購自Novus；抗cleaved caspase-3抗體購自CST；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）均購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

2 主要方法

2.1 研究對象及分組 36只 6 周齡 SPF 級 SD 大鼠購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，其中雌鼠24只（體重180~200 g），雄鼠12只（體重180~200 g），動物合格證號為No. 110324201104015262，飼養(yǎng)于北京大學(xué)第一醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境內(nèi)，每12 h晝夜交替，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，雌雄鼠以 2∶1 比例合籠，母鼠分娩第 1 天記為 P1。24只產(chǎn)后母鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：對照（control）組、低劑量（5 mg·kg-1·d-1）PFOS（low-dose PFOS，PFOSL）組 、中 劑 量（10 mg·kg-1·d-1）PFOS（middle-dose PFOS，PFOS-M）組和高劑量（15 mg·kg-1·d-1）PFOS（high-dose PFOS，PFOS-H）組。從P1 到P21，每天給予染毒組母鼠相應(yīng)劑量的PFOS 灌胃（每100 g 體重給藥1 mL），對照組給予等體積0.5% Tween-20 灌胃，仔鼠自由哺乳。本實驗已通過北京大學(xué)第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號No. 202075。

2.2 標(biāo)本采集及處理 于P35 從各組每窩隨機(jī)選取2只仔鼠，每組共12只，稱重后戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔暴露氣管，結(jié)扎右肺中葉，將注射器插入氣管，緩緩注入4 ℃預(yù)冷的生理鹽水灌洗3次，回收率≥90%。將收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）于 4 ℃、12 000×g離心 5 min，留取上清液，-80 ℃冰箱保存。右肺中葉經(jīng)灌注固定后浸入10%中性福爾馬林48 小時，制作石蠟切片。其余肺組織保存于-80 ℃冰箱。

2.3 肺組織石蠟切片、HE 染色和肺損傷評分 肺組織石蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，隨后依次滴加蘇木素、鹽酸乙醇快速分化液和伊紅染液，染色完成后切片經(jīng)脫水、透明和封片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

利用Smith 肺損傷評分系統(tǒng)［7］對肺組織損傷程度（包括肺泡炎癥、肺泡間質(zhì)炎癥、肺泡出血、肺泡間質(zhì)出血、肺水腫、肺不張、壞死和肺泡透明膜）進(jìn)行評價。按照各損傷項目占所觀察視野的面積進(jìn)行打分（無損傷，0 分；25%，1 分；50%，2 分；75%，3 分；100%，4 分），最后將各損傷項目分?jǐn)?shù)相加即為該視野的肺損傷評分。

2.4 BALF 和肺組織中細(xì)胞因子檢測 留取BALF和肺組織，按照試劑盒說明書檢測BALF 中LDH 活性和肺組織中IL-18、sIL-2R和MPO的含量。

2.5 Western blot 法檢測肺組織中caspase-3、cleaved caspase-3 和GSDME 蛋白表達(dá)量 提取肺組織的總蛋白，用BCA 法測總蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品利用10% SDS-PAGE 分離，電泳完成后使用PVDF 膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，用Western blot 專用封閉液室溫封閉 1 h，Ⅰ抗（caspase-3 抗體，1∶200；cleaved caspase-3 抗體和GSDME 抗體，1∶1000；β-actin 抗體，1∶2000）4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌后，室溫孵育Ⅱ抗（1∶2000）1 h。TBST再次洗滌，利用ECL發(fā)光法進(jìn)行曝光并拍照，采用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，計算上述蛋白相對β-actin的蛋白表達(dá)量。

2.6 免疫組織化學(xué)染色檢測肺組織中GSDME 蛋白表達(dá)水平 肺組織石蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，PBS 洗滌3 次，隨后依次進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷、Tris-EDTA（pH 9.0）抗原熱修復(fù)，待玻片降至室溫后浸泡于PBS 10min，將玻片轉(zhuǎn)移至濕盒內(nèi)，滴加免疫組化專用封閉液室溫封閉30 min，輕甩掉玻片上殘余封閉液，滴加GSDME 抗體（1∶50）4 ℃孵育過夜。玻片于37 ℃復(fù)溫30 min，PBS 洗滌3次后滴加Ⅱ抗（1∶50）室溫孵育20 min，PBS 再次清洗。配制DAB 顯色液，滴加DAB 顯色液約5 min，流動水下終止顯色，蘇木素染核2 min，鹽酸乙醇分化3 s。經(jīng)梯度乙醇、二甲苯脫水透明，中性樹脂封片，鏡下觀察染色情況并拍照，用Image-Pro Plus 軟件分析陽性區(qū)域積分光密度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。方差齊者多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；方差不齊者采用Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況及體重變化

與對照組相比，染毒組仔鼠體型小、毛發(fā)稀疏干枯、活動減少，見圖1。各染毒組仔鼠體重與對照組相比亦顯著降低（P＜0.01），見表1。

Figure 1. Comparison of body size and hair of offspring rats in each group on P35. A：control group（0 mg·kg-1·d-1 PFOS）；B：PFOS-L group（5 mg·kg-1·d-1 PFOS）；C：PFOS-M group （10 mg·kg-1·d-1 PFOS）；D：PFOS-H group（15 mg·kg-1·d-1 PFOS）.圖1 各組子代青春期大鼠的體型和毛發(fā)的對比情況

2 PFOS在子代大鼠肺組織中蓄積

高效液相質(zhì)譜法檢測結(jié)果顯示，哺乳期PFOS 暴露可導(dǎo)致PFOS 蓄積于青春期大鼠肺組織，與對照組相比，PFOS 各劑量組青春期大鼠肺組織中PFOS 濃度顯著增高（P＜0.01），見表1。

表1 哺乳期PFOS暴露對子代青春期大鼠體重的影響Table 1. Body weight and PFOS content in lung tissues of adolescent offspring rats（Mean±SD）

3 各組肺組織病理改變

肺組織石蠟切片HE 染色結(jié)果如圖2 所示，對照組仔鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無炎癥細(xì)胞滲出，支氣管壁和血管壁無增厚。與對照組相比，PFOS 暴露引起了肺組織顯著病理改變，包括肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管管壁、血管壁和肺泡隔增厚、肺泡出血和炎癥細(xì)胞浸潤。此外，PFOS-M組和PFOS-H組可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，形成大肺泡，PFOS-H組可見膠原沉積，伴大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。此外，各暴露組子代青春期大鼠肺損傷評分均較對照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Pathological changes of lung tissues of adolescent offspring rats in each group（HE staining，scale bar=50μm）. A：control group（0 mg·kg-1·d-1 PFOS）；B：PFOS-L group（5 mg·kg-1·d-1 PFOS）；C：PFOS-M group（10 mg·kg-1·d-1 PFOS）；D：PFOS-H group（15 mg·kg-1·d-1 PFOS）. Black arrow：thickened alveolar septa；green arrow：thickened airway intima；red arrow：enlarged alveoli；blue arrow：thickened vascular wall；yellow arrow：collagen deposition in the alveolar wall. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs A.圖2 各組子代青春期大鼠肺組織病理改變

4 肺組織中 IL-18、MPO 和 sIL-2R 水平及 BALF 中LDH活性

PFOS暴露組BALF中LDH活性均較對照組顯著增加（P＜0.05）；與對照組相比，PFOS-L組肺組織中IL-18、MPO 和sIL-2R 含量均無顯著差異（P＞0.05），而 PFOS-M組和 PFOS-H組肺組織中 IL-18、MPO 和sIL-2R水平均顯著升高（P＜0.01），見圖3。

5 哺乳期PFOS 暴露激活子代青春期大鼠肺組織GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

各組肺組織免疫組化結(jié)果顯示，GSDME 蛋白（胞質(zhì)內(nèi)棕色區(qū)域）表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，且中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亦有表達(dá)；與對照組相比，PFOS-M組和PFOS-L組GSDME蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），尤其是支氣管上皮細(xì)胞，見圖4。Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比 ，PFOS-M組 和 PFOS-L組 肺組 織 中 caspase-3 和GSDME蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見圖5。

討 論

對嬰兒而言，母乳喂養(yǎng)具有營養(yǎng)支持和免疫支持等眾多益處。但母乳可能含有許多來自于食物、藥品或環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，嬰兒可通過母乳接觸這些化學(xué)物質(zhì)，而PFOS 是其中的一種重要的化合物。據(jù)報道，通過母乳攝入的PFOS 占6 月齡嬰兒PFOS總攝入量的94%，提示母乳是嬰兒極其重要的PFOS暴露源［8］。本研究顯示，給予哺乳期母鼠PFOS 灌胃，在青春期子代大鼠肺組織內(nèi)可以檢測到濃度較高的PFOS，提示PFOS 不僅可以經(jīng)母乳使子代大鼠暴露，還可以在子代大鼠體內(nèi)存在較長時間。

生命早期暴露并蓄積于子代體內(nèi)的PFOS 具有慢性毒性作用。研究表明，宮內(nèi)或哺乳期暴露于PFOS 可能與生命后期的某些不良后果有關(guān)。近來，Varsi 等［9］通過研究母體孕期和哺乳期的 PFAS 水平與嬰兒體內(nèi)PFAS 的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，母體的PFAS 水平在孕期和哺乳期持續(xù)降低，然而嬰兒體內(nèi)的PFAS 隨著哺乳時間的延長而持續(xù)升高，6月齡達(dá)高峰。這一結(jié)果再次證明母體PFAS 可以經(jīng)母乳轉(zhuǎn)移給嬰兒。該研究還提示，6 月齡嬰兒體內(nèi)的PFAS 濃度與較差的粗大運(yùn)動發(fā)育相關(guān)。此外，宮內(nèi)或哺乳期暴露于PFOS 可降低男孩 7 歲時的智力水平［10］，增加女孩兒童時期注意力缺陷多動障礙患病率［11］，導(dǎo)致脂質(zhì)和膽汁酸代謝紊亂，加快遺傳易感性兒童發(fā)展為乳糜瀉的進(jìn)程［12］。這些研究提示生命早期PFOS 暴露對后期健康水平有持續(xù)損害作用。本研究顯示，哺乳期PFOS 的間接暴露對子代大鼠的毒性作用直至青春期仍可觀察到，PFOS 阻礙子代大鼠整體的生長，導(dǎo)致子代大鼠體型減小、體重減輕，神經(jīng)毒性亦很顯著，表現(xiàn)為仔鼠活動減少、易激惹、抽搐等癥狀。

Figure 3. The IL-18（A），sIL-2R（C）and MPO（D）concentrations in lung tissues and the LDH activity in BALF（B）of adolescent offspring rats in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 各組子代青春期大鼠肺組織中IL-18、sIL-2R和MPO濃度及BALF中LDH活性

Figure 4. Immunohistochemical staining of GSDME in lung tissues of adolescent offspring rats in each group（scale bar=50 μm）. A：control group（0 mg·kg-1·d-1 PFOS）；B：PFOS-L group（5 mg·kg-1·d-1 PFOS）；C：PFOS-M group（10 mg·kg-1·d-1 PFOS）；D：PFOS-H group（15 mg·kg-1·d-1 PFOS）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs A.圖4 各組子代青春期大鼠肺組織中GSDME免疫組織化學(xué)染色

PFOS 可能具有慢性肺毒性作用。有研究人員利用放射性元素35S 標(biāo)記研究暴露后PFOS 在小鼠各個組織器官的分布情況，結(jié)果顯示PFOS 暴露后第5天小鼠肺組織中的PFOS 含量（47 nmol/g）僅次于肝臟（129 nmol/g），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液（19 nmol/g）、腎臟（18 nmol/g）和大腦（5 nmol/g）［13］，提示肺極易受 PFOS 暴露的影響。目前認(rèn)為，生命早期的某些危險因素可促進(jìn)某些慢性肺病如慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)?。?4］。在肺發(fā)育早期氣道上皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞炎癥被激活，可破壞肺組織彈性蛋白的組裝，使肺組織呈類COPD樣表現(xiàn)，肺泡呈肺氣腫樣改變，伴永久性肺功能降低［15］。這提示在肺發(fā)育早期，中性粒細(xì)胞炎癥可能是導(dǎo)致永久性肺損害的重要因素。MPO是中性粒細(xì)胞分泌的一種降解酶，目前認(rèn)為MPO 直接參與了吸入化學(xué)物質(zhì)相關(guān)肺炎癥性損傷的過程［16］。本研究結(jié)果表明，哺乳期PFOS 暴露后，在暴露組子代青春期大鼠肺組織內(nèi)可見大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，提示青春期大鼠肺內(nèi)可能仍存在慢性炎癥。此外，青春期子代大鼠肺組織的MPO 水平顯著升高，肺泡正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺泡壁斷裂，肺泡腔擴(kuò)大。因此，我們推測哺乳期PFOS 暴露可能激活了肺組織中性粒細(xì)胞炎癥，導(dǎo)致肺損傷和肺泡呈COPD樣改變。

Figure 5. Exposure to PFOS activated GSDME-mediated pyroptosis signaling pathway. The protein levels of GSDME，caspase-3 and cleaved caspase-3 in lung tissues of adolescent offspring rats in each group were measured by Western blot. Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖5 各組子代青春期大鼠肺組織中caspase-3、cleaved caspase-3和GSDME蛋白表達(dá)水平

促炎和抗炎機(jī)制的平衡對維持肺部免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［17］。促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡是維持免疫穩(wěn)態(tài)的機(jī)制之一，炎癥反應(yīng)失控可導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生?！凹?xì)胞因子風(fēng)暴”的概念最初用來描述機(jī)體感染時免疫系統(tǒng)紊亂和炎癥反應(yīng)失控的現(xiàn)象，目前發(fā)現(xiàn)，在多種非感染性疾病中也觀察到細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生［18］。在本研究中，PFOS 暴露組子代青春期大鼠肺組織中除了上述的MPO 外，其他細(xì)胞因子（IL-18 和sIL-2R）的水平也顯著增加，伴子代大鼠生長顯著受限，甚至出現(xiàn)神經(jīng)毒性和死亡，提示PFOS 很可能引起了細(xì)胞因子風(fēng)暴。肺損傷是細(xì)胞因子風(fēng)暴的常見后果，其特征是急性期單核/中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)為慢性纖維增殖期，肺部出現(xiàn)膠原沉積［18］。在本研究中，PFOS 暴露除了導(dǎo)致子代大鼠肺組織中大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤之外，還可見肺泡隔顯著增厚，肺泡壁中出現(xiàn)膠原沉積，提示PFOS 引起了子代大鼠慢性肺損傷。然而，目前尚不清楚PFOS誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的潛在機(jī)制。

近年研究表明，某些化合物（如化療藥物）的細(xì)胞毒性可能與GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡有關(guān)［19］。細(xì)胞焦亡是一種新型的細(xì)胞程序性死亡方式［20］，在諸多疾病的炎癥性病理改變中發(fā)揮重要作用。當(dāng)細(xì)胞感受到危險信號，使caspase-3活化，活化的caspase-3裂解GSDME，后者釋放具有成孔活性的N 端片段（GSDME-N），隨后GSDME-N 與質(zhì)膜結(jié)合形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，胞內(nèi)容物例如LDH、IL-18 等釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)［21］。研究表明，細(xì)胞焦亡可能是將器官損傷與細(xì)胞因子風(fēng)暴聯(lián)系起來的潛在機(jī)制之一，且細(xì)胞焦亡在無菌性器官損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［22］。本研究結(jié)果表明，PFOS 暴露后肺泡灌洗液中LDH 活性顯著增加，提示肺組織細(xì)胞的死亡。此外，PFOS 暴露導(dǎo)致子代青春期大鼠肺組織中caspase-3和GSDME 蛋白表達(dá)量顯著增加，多種細(xì)胞因子水平顯著升高，我們推測PFOS 可能激活肺組織GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡并引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。

綜上所述，哺乳期通過母乳暴露于PFOS 對子代大鼠的毒性作用直至青春期仍十分顯著。首先，哺乳期PFOS 間接暴露顯著影響了子代青春期大鼠的體重增長；其次，PFOS 還具有慢性肺毒性，導(dǎo)致子代青春期大鼠肺組織COPD 樣改變和慢性肺損傷。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PFOS 的慢性肺毒性作用可能與GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡及其所引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)。因此，PFOS 對子代各系統(tǒng)各器官生長發(fā)育的不利影響持久而深遠(yuǎn)，而GSDME 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡通路及所誘發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴有望成為預(yù)防和治療環(huán)境污染物暴露所致相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。