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      NATD/FOXA2信號通路對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用及其機制*

      2022-05-06 05:36:50肖紅艷
      中國病理生理雜志 2022年4期
      關(guān)鍵詞:蛋白質(zhì)乳腺癌小鼠

      肖紅艷, 方 芳, 顧 林

      (天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院乳腺二科,國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心,天津市腫瘤防治重點實驗室,天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心,乳腺癌防治教育部重點實驗室,天津 300060)

      絕大多數(shù)與乳腺癌相關(guān)的死亡是由于轉(zhuǎn)移到遠處器官,例如肺和骨骼[1]。腫瘤細胞經(jīng)歷遺傳和表觀遺傳變化以獲得轉(zhuǎn)移能力[2]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HATs)是表觀遺傳學研究最廣泛的一類酶,通過組蛋白上乙?;某练e來修飾染色質(zhì)[3]。重要的是,HAT 酶的調(diào)節(jié)顯著改變了正常的基因表達,并與包括癌癥在內(nèi)的幾種疾病的發(fā)展有關(guān)[4-5]。盡管在過去幾十年中描述了許多HATs 在基因調(diào)控和腫瘤發(fā)生中的作用,但其中一些酶的功能在很大程度上仍然未知,如N 末端乙?;D(zhuǎn)移酶(N-terminal acetyltransferases,NATs)主要修飾蛋白質(zhì)或多肽的 N 端 α-氨基[6]。N-α-乙酰基轉(zhuǎn)移酶D(N-α-acetyltransferase D,NATD)屬于NATs 家族成員之一,具有GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族的保守序列基序,使其能專一地介導組蛋白H4和H2A的Nt乙?;?,并在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7]。最近的一項研究表明,NATD 是侵襲性肝癌亞型潛在預后標志物[8]。此外,NATD 在肝細胞癌組織中顯示下調(diào),并且異位NATD 表達使肝癌細胞系對藥物誘導的凋亡敏感[9]。盡管有上述證據(jù),NATD在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),腫瘤來源的NATD 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A2(forkhead box protein A2,F(xiàn)OXA2)表達以促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移,并且該過程涉及腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)發(fā)生。因此,NATD 可能成為乳腺癌的潛在治療靶點。

      材料和方法

      1 細胞

      人細胞系MDA-MB-231 及其對肺轉(zhuǎn)移衍生物LM2-4175(LM2)、MCF10CA1h 及其轉(zhuǎn)移性等基因系MCF10CA1a 均購自 ATCC。MDA-MB-231 及 LM2 接種在含有10%胎牛血清(HyClone)和100 mg/L 青霉素/鏈霉素(Gibco)的 DMEM 培養(yǎng)液(HyClone)中生長。MCF10 系列細胞系在補充有10 mg/L 胰島素、20 μg/L 表皮生長因子、0.5 μg/L 氫化可的松、100μg/L 青霉素/鏈霉素和 20% 馬血清(HyClone)的DMEM/F12 培養(yǎng)液(HyClone)中生長。每周使用第5~8代的細胞培養(yǎng)物測試支原體污染。

      2 方法

      2.1 癌細胞中蛋白的質(zhì)譜分析 通過刮刀或胰蛋白酶處理收集培養(yǎng)的細胞,用裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS 與磷酸酶和蛋白酶抑制劑)在冰上裂解 15 min,然后以 17 000×g離心 15 min。用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。上樣30μg 的蛋白質(zhì),并在8%~12% SDS-PAGE 分離。每條泳道被切割成12個部分。將每個切片切成約1 mm×1 mm×1 mm的立方體,然后將凝膠片在100%乙腈中脫水15 min,通過SpeedVac 完全干燥,在50 μL 含有0.01 μg/μL 胰蛋白酶(Promega)的25 mmol/L 碳酸氫銨(Promega)中溶脹,并在37 ℃下孵育過夜。肽段用含5%甲酸的50%乙腈提取4 次。將所得肽段在MDLC 系統(tǒng)(Michrom Bioresources)與 Thermo Finnigan 2D 線性離子阱質(zhì)譜儀(Thermo)耦合上進行納米LCMS/MS實驗。所有數(shù)據(jù)文件都是通過對人類國際蛋白質(zhì)指數(shù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(IPI. Human. v3.67.fasta)搜索 MS/MS 譜圖創(chuàng)建,使用 BioWorks 3.3 軟件套件中的TurboSEQUEST 程序,前體-離子質(zhì)量容差為2.0 amu,碎片離子質(zhì)量容差為0.8 amu。胰蛋白酶被設(shè)置為蛋白酶,允許有兩個缺失的切割位點。搜索的肽段和蛋白質(zhì)在Trans-Proteomic Pipeline(TPP)4.2 中使用默認參數(shù)通過PeptideProphet1 和ProteinProphet2 進行驗證。ProteinProphet P 值大于0.9 且具有不少于3 種獨特肽段的蛋白質(zhì)被認為是真正的鑒定。隨機IPI.HUMAN.v3.67.fasta 用作數(shù)據(jù)庫來估計蛋白質(zhì)識別的錯誤發(fā)現(xiàn)率。在我們的分析中,ProteinProphet 0.9的錯誤發(fā)現(xiàn)率<1%。將含有相同肽段的蛋白質(zhì)分組,每組中只剩下一種概率最高的蛋白質(zhì)。

      2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將全長人NATD 基因克隆到pMSCV 載體(Clontech)中以產(chǎn)生NATD表達質(zhì)粒。NATDshRNA(sh-NATD)質(zhì)粒購自Sigma。所有質(zhì)粒均通過DNA 測序驗證。將MDA-MB-231、LM2 細胞接種在6 孔板中,生長至80%~90%匯合度并用X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中,以進行NATD過表達和敲除。對于救援實驗,MDA-MB-231細胞與FOXA2和NATD過表達質(zhì)粒體共轉(zhuǎn)染48 h,收獲細胞用于后續(xù)分析。針對FOXA2過表達質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

      2.3 人乳腺癌組織及免疫組化分析 石蠟包埋的原發(fā)腫瘤146 個從天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院獲得。分別對其中具有隨訪信息的樣本用于轉(zhuǎn)移(n=96)和具有總生存信息的樣本用于總生存(n=58)的Kaplan-Meier 分析。研究經(jīng)所有受試者的知情同意和醫(yī)院機構(gòu)的倫理委員會批準研究。將石蠟固定的標本切成4μm 厚,并附著在玻片上。然后將腫瘤組織切片在二甲苯中脫蠟并用梯度乙醇脫水。用蒸餾水沖洗后,在室溫下用3.0%過氧化氫阻斷組織過氧化物15 min。抗原在檸檬酸緩沖液中用微波加熱修復。然后將載玻片冷卻至室溫。用PBS洗滌3次后,用抗NATD 抗體孵育載玻片。通過HRP 連接的Ⅱ抗顯示結(jié)合的Ⅰ抗。在倒置顯微鏡拍攝圖像。根據(jù)腫瘤的染色強度中值將樣本分為NATD 高表達組和低表達組并用于生存分析。

      2.4 小鼠實驗 從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買了6~8 周齡Balb/c 雌性小鼠。小鼠被麻醉并向尾靜脈注射NATD過表達或敲除乳腺癌細胞(MDA-MB-231 和 LM2 細胞:2.5×105)用于肺轉(zhuǎn)移。對于生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging,BLI),通過給小鼠腹腔注射底物D-熒光素(150 mg/kg),然后使用IVIS 光譜儀(PerkinElmer)監(jiān)測腫瘤細胞的全身擴散,并在不同時間點使用BLI 測量了肺部轉(zhuǎn)移負擔。使用Living Image 2.50 分析BLI 圖像。通過人工繪制肺輪廓對應(yīng)區(qū)域內(nèi)BLI 信號的光子通量來測量肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負擔。

      2.5 微陣列分析技術(shù) 分別使用Affymetrix 人類基因2.0 ST 陣列對LM2 和MCF10CA1a 進行基因表達微陣列分析,包括或不包括NATD敲除。使用默認設(shè)置的R 軟件包“Oligo”對數(shù)據(jù)進行分析,并使用魯棒多芯片平均算法(RMA)對原始數(shù)據(jù)進行歸一化。將對照組和NATD基因敲除組之間表達水平變化1.5倍或更大(t檢驗P<0.05)的基因定義為差異表達基因。

      2.6 反相蛋白質(zhì)陣列分析 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染NATD敲除的LM2 和MCF10CA1a 的蛋白裂解物連續(xù)稀釋并排列在硝酸纖維素涂層的載玻片上。在上海伯豪生物技術(shù)有限公司對載玻片上的蛋白質(zhì)裂解物進行反相蛋白質(zhì)陣列分析分析。通過標準化log2 轉(zhuǎn)化和以抗體為中心的中值來表示蛋白質(zhì)和磷蛋白的表達水平。使用Studentt檢驗確定對照組和NATD基因敲除組之間的蛋白質(zhì)表達差異,雙側(cè)P<0.05。

      2.7 高通量測序數(shù)據(jù)分析 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀測序(RIP-seq)研究樣本均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司在Illumina HiSeq 2500 進行,單端讀取長度為50 bp。使用hisat2 將深度測序數(shù)據(jù)與人類參考基因組版本38(GRCh38)比對?;蚪Y(jié)構(gòu)注釋通過R 軟件包BioMart 從BioMart 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集hsapiens_Gene_ensembl 中提取。如果相應(yīng)基因具有多個異構(gòu)體,則使用最長的異構(gòu)體,并將對齊的讀取擴展到150 bp 以滿足平均片段大小。為了平衡峰值調(diào)用中內(nèi)含子的干擾,我們將基因結(jié)構(gòu)注釋從基于基因組的坐標轉(zhuǎn)換為基于最長異構(gòu)體的坐標。每個基因每個窗口的讀取計數(shù)通過相應(yīng)基因所有窗口的中值讀取計數(shù)進行標準化。RIP富集峰(窗口)通過FDR<0.05 和富集分數(shù)的 log2 轉(zhuǎn)換≥1 確定。通過 Fisher 精確測試P值調(diào)整FDR,該值評估RIP和輸入樣本之間的差異窗口。通過(IP_C×Input_MedC)(/IP_MedC×Input_C)計算窗口富集分數(shù)。IP_C:當前峰值中RIP樣本的讀取計數(shù);IP_MedC:當前異構(gòu)體上所有窗口中RIP 樣本的中值讀取計數(shù);Input_C:讀取當前峰值中輸入樣本的計數(shù);Input_MedC:當前異構(gòu)體上所有窗口中輸入樣本的中值讀取計數(shù)。每個基因中RIP-seq 的標準化分布是每個亞型中每個位點的讀取計數(shù),通過選取相應(yīng)亞型中所有位點的中值對讀取計數(shù)標準化。

      2.8 細胞遷移和侵襲測定 在Transwell 室(BD Biosciences)中檢測細胞遷移能力。細胞接種在上室孵育24 h,將滲透到下表面的遷移細胞固定并用結(jié)晶紫(Sigma-Aldrich)染色。對于侵襲測定,基質(zhì)凝膠預涂在上室的聚碳酸酯膜上,其他同遷移能力測定。用BX-60顯微鏡(Olympus)觀察細胞。

      2.9 免疫熒光測定 MDA-MB-231 細胞用指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并鋪在室載玻片上。細胞在3.7%甲醛中固定,并在室溫下用0.15%Triton X-100 滲透。然后洗滌細胞,用5% BSA 封閉并與抗E-鈣黏蛋白(1∶500,Cell signaling Technology)和抗N-鈣黏蛋白(1∶800,Cell signaling Technology)抗體在4 ℃溫育16 h。然 后 用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 偶 聯(lián) II 抗(Thermo Fisher Scientific)探測細胞,用DAPI 染色并固定在顯微鏡載玻片上。使用Leica 共聚焦系統(tǒng)(Leica)對細胞進行成像。

      2.10 Western blot 使用RIPA 裂解緩沖液(Abcam)從細胞中提取總蛋白。將50μg 細胞裂解物電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(GE Healthcare)。然后封閉膜并用抗NATD(1∶1 000)、FOXA2(1∶800)、E-鈣粘蛋白(1∶2 000)、N-鈣粘蛋白(1∶1 000)、波形蛋白(1:500)和GAPDH(1∶5 000)抗體在4 ℃孵育過夜。洗滌膜并用HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗進行探測。所有抗體均購自Abcam。ECL 底物用于觀察印跡。用ImageJ軟件分析相對條帶強度。

      3 統(tǒng)計學處理

      本研究中的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 進行分析,并表示為至少3 個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)。組間比較采用雙尾Student'st檢驗,多組間比較采用單向方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。繪制Kaplan-Meier 生存曲線分析乳腺癌中NATD 表達對總體存活率、無轉(zhuǎn)移生存的影響,以及NATD過表達或敲減對小鼠的無轉(zhuǎn)移生存期的影響,組間比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      結(jié) 果

      1 NATD表達與乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

      質(zhì)譜組學分析顯示共有30 個蛋白在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞中的表達上調(diào),其中NATD 是受調(diào)控的蛋白質(zhì)之一(圖1A)。此外,Western blot 也證實了NATD 蛋白在LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移腫瘤細胞中的表達高于MDA-MB-231 和MCF10CA1h 親本腫瘤細胞(圖1B)。為了進一步驗證NATD 表達的臨床相關(guān)性,我們通過NATD 免疫組化染色分析了一組人類乳腺腫瘤(圖1C),發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中較高的NATD 表達與患者的總生存期縮短(HR=3.673,95% CI=1.611~8.376,P=0.003)和無轉(zhuǎn)移縮短(HR=3.347,95%CI=1.740~6.438,P=0.001)有關(guān)(圖1D、E)。這些結(jié)果表明NATD與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)。

      Figure 1. NATD expression was related to breast cancer cell metastasis. A:MS omics analysis heatmap of breast cancer cell lines with different metastatic ability;B:The expression of NATD protein in breast cancer cell lines with different metastatic ability was analyzed by Western blot(I:MDA-MB-231;II:LM2;III:MCF10CA1h;IV:MCF10CA1a);C:the low expression and high expression of NATD in breast cancer tissues were demonstrated by immunohistochemistry;D:comparison of overall survival rate between high and low expression of NATD in breast cancer(n=58);E:comparison of metastasis-free survival between high and low expression of NATD in breast cancer(n=96).圖1 NATD表達與乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

      2 NATD促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

      然后我們探討了NATD 在肺轉(zhuǎn)移中的功能作用。分別在MDA-MB-231 細胞和LM2 細胞中過表達或敲減NATD,并通過Western blot 驗證(圖2A)。將NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi),結(jié)果顯示,與pMSCV 對照組相比,NATD 過表達組顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負擔(圖2B、C)并縮短了動物的存活期(圖2D)。相比之下,將NATD敲減的LM2 癌細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi),減少了小鼠的肺定植并延長了無轉(zhuǎn)移生存期(圖2E~G)。

      Figure 2. NATD promoted lung metastasis of breast cancer. A:overexpression and knockdown of NATD in MDA-MB-231 and LM2 were verified by Western blot. B,C and D:MDA-MB-231 overexpressing NATD was injected intravenously for lung metastasis analysis. B:bioluminescence imaging(BLI)quantification and representative images(n=10);C:Lung surface nodules quantification and representative images(n=5);D:animal survival rate(n=8). E,F(xiàn) and G:intravenous injection of NATD knockdown LM2 for lung metastasis analysis. E:bioluminescence imaging(BLI)quantification and representative images(n=10);F:lung surface nodules quantification and representative images(n=5);G:animal survival rate(n=8).Mean±SD.**P<0.01 vs pMSCV group;△△P<0.01 vs sh-NC group.圖2 NATD促進乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移

      3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq 分析鑒定NATD靶標

      為了研究NATD 在轉(zhuǎn)移中的分子機制,我們使用反相蛋白質(zhì)陣列分析了NATD敲減的LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移癌細胞的蛋白質(zhì)表達,其涵蓋了主要信號通路中的蛋白質(zhì)標記物。在分化表達的蛋白質(zhì)中,有34 個蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著改變(22 個蛋白質(zhì)上調(diào),12個蛋白質(zhì)下調(diào))(圖3A)。接下來,在LM2細胞中進行NATD RNA 免疫沉淀測序(RIP-seq),并在22 個上調(diào)蛋白質(zhì)中,發(fā)現(xiàn) 3 個基因(FOXA2、ABL1和MSH6)的mRNA 與NATD 蛋白結(jié)合(圖3B),表明它們是NATD 的直接目標。已知FOXA2對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移很重要;其他2 個基因在轉(zhuǎn)移中的功能目前尚未見報道。一致地,LM2 和MCF10CA1a 細胞中的NATD敲減也在體外上調(diào)這些基因的蛋白水平(圖3C)。

      4 FOXA2是NATD在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中的必需靶點

      為了研究NATD 是否通過調(diào)節(jié)NATD 軸發(fā)揮作用,我們在MDA-MB-231 細胞中過表達 NATD 和FOXA2。在NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞中,F(xiàn)OXA2 表達明顯降低(圖4A)。然而,在NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞中,F(xiàn)OXA2 過表達在一定程度下調(diào)NATD 表達和上調(diào) FOXA2 表達(圖 4A、B)。NATD 過表達介導的對MDA-MB-231 細胞侵襲和遷移的促進作用被FOXA2 過表達逆轉(zhuǎn)(圖4C、D)。此外,免疫熒光和Western blot 印跡分析顯示,NATD 過表達介導MDA-MB-231 細胞的EMT 過程,而FOXA2過表達逆轉(zhuǎn)了NATD 對EMT 過程的誘導作用(圖4E~H)。這些數(shù)據(jù)提示NATD 可能通過調(diào)節(jié)FOXA2來抑制乳腺癌的EMT和轉(zhuǎn)移。

      Figure 3. Identification of NATD targets by high-throughput reversed-phase protein array and RIP-Seq analysis. A:supervised hierarchical clustering analysis of the differential expression of 34 proteins identified by the high-throughput reverse-phase protein array between NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells;B:RNA immunoprecipitation sequencing(RIP-seq)showed the combination of NATD with a single mRNA of the transferred gene in LM2 cells[the normalized reading distribution of Input(blue)and NATD(red)along the mRNA];C:Western blot analysis of NATD protein expression levels in NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells.圖3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq分析鑒定NATD靶標

      討 論

      隨著早期診斷和全身治療的進步,大多數(shù)早期非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者被認為有可能治愈[10]。然而,轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍然被認為是無法治愈的,死亡率很高[11]。因此,探索轉(zhuǎn)移機制是開發(fā)更有效的乳腺癌療法的關(guān)鍵。EMT 是轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的第一步,以促進癌細胞從原發(fā)腫瘤逃逸[12]。在這項研究中,我們證明NATD 可能通過下調(diào)FOXA2的表達來抑制乳腺癌的EMT 和轉(zhuǎn)移。與其他研究一致,我們的數(shù)據(jù)揭示了NATD/FOXA2 軸在EMT 和乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用,并表明NATD/FOXA2 軸是開發(fā)治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在分子靶點。

      Figure 4. FOXA2 overexpression can inhibit the EMT and metastasis of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells were transfected with plasmids against NATD and/or FOXA2. A:the expression of NATD and FOXA2 protein were analyzed by Western blot(n=3);B:Transwell analysis of MDA-MB-231 cells(n=3);C:immunofluorescence detection of E-cadherin(green)and N-cadherin(red)immunofluorescence staining(n=3,×100);D:the expression of E-cadherin,N-cadherin and vimentin protein were analyzed by Western blot(n=3). Mean±SD.**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs NATD group.圖4 FOXA2過表達可抑制MDA-MB-231細胞的EMT和轉(zhuǎn)移

      組蛋白修飾在基因調(diào)控中具有重要作用[13]。然而,即使這種修飾很豐富,并且相應(yīng)的NAT酶在真核生物中高度保守,但是組蛋白H4的N-α-末端乙酰化的功能仍然不確定[14]。最近發(fā)現(xiàn)NAT酶在幾種人類癌癥的發(fā)展和進展中的關(guān)鍵作用突出了它們的重要臨床意義[15-16]。有研究證實,NATA 復合物(Naa10p,NATA 復合物的催化亞基)與腫瘤有關(guān),并且對于維持增殖和確保各種癌細胞的存活至關(guān)重要[17]。由于NATD 催化活性僅限于組蛋白H4 和H2A,最近研究發(fā)現(xiàn)NATD 可通過不依賴p53 的機制在結(jié)直腸癌細胞中具有抗凋亡作用,并且NATD-KD 細胞對化療治劑表現(xiàn)出更高的敏感性[18]。此外,臨床觀察顯示,肺癌組織中的NATD 表達水平較鄰近的正常組織顯著升高,并且與患者的存活率呈負相關(guān),證實了NATD促進肺癌進展[7]。本研究擴展了先前的研究發(fā)現(xiàn),證實了NATD 在轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞中的表達高于親本癌細胞,并且NATD過表達的MDA-MB-231細胞顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負擔。相比之下,NATD敲減的LM2 細胞減少了小鼠的肺定植并延長了無轉(zhuǎn)移生存期。這些發(fā)現(xiàn)證明了NATD 在乳腺癌中的促轉(zhuǎn)移作用。

      最近研究證實組蛋白修飾與EMT 密切相關(guān)[19]。要進行EMT,癌細胞需要獲得除遺傳變化以外的表觀遺傳變化[20]。這項研究通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列RIP-Seq分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子FOXA2為NATD靶標。FOXA2 屬于轉(zhuǎn)錄因子的叉頭/翼狀螺旋家族[21],參與胚胎發(fā)育,并在來自三個胚層的多個成體組織中廣泛表達和發(fā)揮作用[22]。FOXA2在多種人類腫瘤中發(fā)揮作用,如肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌,并且FOXA2 的持續(xù)表達通??梢苑乐股鲜瞿[瘤的進展[23-25]。FOXA2 在正常人乳腺上皮細胞中表達,但其表達因臨床乳腺癌樣本中FOXA2 基因甲基化增加而下調(diào),表明 FOXA2 影響乳腺癌進展[26]。FOXA(HNF-3)是維持上皮標志物E-cadherin表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,提示FOXA2 參與了EMT 的調(diào)控[27]。許多研究還證實,F(xiàn)OXA2 通過抑制各種人類腫瘤(如胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌)中的EMT,起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[28-30]。更重要的是,本研究中乳腺癌細胞中FOXA2的表達水平與NATD 的表達水平密切相關(guān),過表達NATD 通過抑制FOXA2 表達進而誘導EMT 過程。這些發(fā)現(xiàn)確定了NATD 在基因表達調(diào)控中的新功能,并擴展了我們對EMT 表觀遺傳調(diào)控的理解。在我們的結(jié)果中,F(xiàn)OXA2 是NATD 介導EMT 過程的直接表觀遺傳靶點。然而,考慮到NATD調(diào)節(jié)多個基因表達的能力,本研究不能完全排除由NATD 直接調(diào)節(jié)的其他基因有助于獨立于FOXA2表達的遷移和侵襲的可能性。

      總之,在本研究中,我們首次證明NATD 通過控制FOXA2 介導的EMT 來促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果不僅揭示了乳腺癌轉(zhuǎn)移的新調(diào)控機制,而且為開發(fā)治療乳腺癌的新策略提供了潛在的靶點。根據(jù)我們的數(shù)據(jù),靶向NATD/FOXA2 軸可能是治療乳腺癌的新策略。

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      人工智能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
      海外星云(2021年9期)2021-10-14 07:26:10
      小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
      乳腺癌是吃出來的嗎
      胸大更容易得乳腺癌嗎
      別逗了,乳腺癌可不分男女老少!
      祝您健康(2018年5期)2018-05-16 17:10:16
      米小鼠和它的伙伴們
      蛋白質(zhì)計算問題歸納
      Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
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