MEN1缺失通過誘導DNA損傷累積抑制乳腺癌細胞的惡性表型*

梁 黎， 楊云巧， 朱佳美 ， 潘 婷， 周潤蕾， 鄧英蕾， 陳騰祥，，3，郭 兵 ，3， 李海洋 ， 金幫明 ，，3△， 毛大華 △

（1貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，2貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，3貴州醫(yī)科大學貴州省常見慢性病發(fā)病機制和藥物研究重點實驗室，4貴州醫(yī)科大學附屬烏當醫(yī)院，貴州 貴陽 550502）

乳腺癌是在全世界女性中常見的惡性腫瘤，美國預計每年有超過26.8 萬的確診病例，約占女性所有新癌癥病例的30%；在中國，乳腺癌已成為女性發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤（發(fā)病率為19.2%，死亡率為9.1%）［1-2］，是導致女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。根據(jù)乳腺癌的分子分型將乳腺癌分為Luminal A 型、Luminal B 型、Erb-B2過表達型和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）［3］。TNBC 是一種雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性表達的乳腺癌［4］。流行病學數(shù)據(jù)顯示，TNBC 主要發(fā)生在40 歲以下的絕經(jīng)前年輕女性，約占所有乳腺癌患者的15%~20%［5］。與其他亞型乳腺癌相比，TNBC 患者的生存時間較短，在確診后的頭5 年內(nèi)死亡率為 40%［6］。TNBC 是高度侵襲性腫瘤，約 46% 的TNBC 患者表現(xiàn)為腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，常見于大腦和內(nèi)臟器官，轉(zhuǎn)移后中位生存期僅13.3 個月，術(shù)后復發(fā)率高達25%［7］。由于其特殊的分子表型，TNBC 對內(nèi)分泌治療或分子靶向治療不敏感?；熓侵饕娜碇委煼椒?，但術(shù)后常規(guī)輔助放化療療效較差，殘留的轉(zhuǎn)移灶最終會導致腫瘤復發(fā)［8-9］。因此，迫切需要開發(fā)新的治療方案和尋找新的治療靶點。

多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1 型（multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1）綜合征是由MEN1基因的種系突變失活引起的，主要以甲狀旁腺腺瘤、垂體腺瘤和胰腺瘤等神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤為特征［10-11］。MEN1基因（小鼠為Men1）定位于人類染色體11q13，編碼610個氨基酸殘基組成的menin蛋白，為多組織表達的核蛋白。研究表明menin 在肺［12］和前列腺［13］等器官中發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用，并在小鼠模型中抑制孕鼠胰腺β 細胞生長并加重糖尿病病情［14-15］。研究報道，女性MEN1綜合征患者呈MEN1基因的純合缺失，提示MEN1是一個潛在的抑癌因子［16］。然而，有研究顯示，MEN1基因具有促進散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能，menin的過表達參與乳腺癌細胞內(nèi)分泌治療抗性的產(chǎn)生［17］，提示在乳腺癌中MEN1通過不同的機制行使抑癌和促癌的雙重功能。這些研究表明MEN1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用并無一致定論。基于此，本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫、臨床乳腺癌樣本、MEN1基因敲除乳腺癌細胞系統(tǒng)分析MEN1基因在乳腺癌細胞惡性表型及藥物敏感性調(diào)控中的作用，并闡明其調(diào)控機制，為以MEN1及其調(diào)控的關(guān)鍵靶基因為靶點開發(fā)乳腺癌治療藥物提供參考資料。

材料和方法

1 臨床組織標本

2021 年 3 月~2021 年 8 月 在貴州 醫(yī)科大 學附屬烏當醫(yī)院乳腺外科收集乳腺癌及癌旁組織17 例。所有乳腺癌樣品均從進行乳腺癌切除術(shù)的患者中收集，乳腺癌患者經(jīng)病理學確診，且術(shù)前未接受過放、化療，術(shù)前3 個月內(nèi)未進行過任何藥物治療。本研究獲得所有參與者的知情同意，醫(yī)院倫理委員會予以批準通過。每例樣本離體后，保存于液氮中，用于RT-qPCR和免疫組織化學染色分析。

2 細胞與試劑

乳腺癌細胞系MDA-MB-231 細胞、MDA-MB-468細胞（TNBC 細胞）和MCF-7（Luminal A 型）細胞購自ATCC；DMEM 培養(yǎng)液購自 Gibco；L-15 培養(yǎng)液購自上海源培生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Biological Industries；Trizol 試劑、細胞凋亡檢測試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海翔圣生物科技有限公司；TB Green Premix Ex TaqTMⅡ購自Ta-KaRa；CCK-8 試劑盒購自 GLPBIO；EdU 試劑盒、Alexa Fluor 555 標記驢抗鼠IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲基硝基亞硝基胍（methyl nitronitrosoguanidine，MNNG）、MI-3 和他莫昔芬（tamoxifen，TAM）購自MCE；阿霉素（doxorubicin, DOX）和紫杉醇（taxol，TAX）購自大連美倫公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化兔二步法檢測試劑盒/鼠二步法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋有限公司；抗熒光衰減封片劑購自RUITAIBIO；兔多克隆menin 抗體購自BETHYL；兔多克隆53BP1 抗體和鼠單克隆RAD51 抗體購自NOVUS；鼠單克隆BRCA1抗體購自Abcam；鼠單克隆γH2AX 抗體、兔單克隆KU70 抗體購自Cell Signaling Technology；兔單克隆Tubulin 抗體購自Abcam；0.25%胰蛋白酶、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgGⅡ抗購自北京塞維爾公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析 從腫瘤基因組圖譜（網(wǎng)址：http：//ualcan.path.uab.edu/）獲得MEN1在人正常乳腺和乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平以及MEN1在正常乳腺組織、Luminal型、HER2 陽性型和三陰性乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平。

3.2 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞和MDA-MB-468細胞培養(yǎng)于L-15 培養(yǎng)液，MCF-7 細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素）中，置于37 ℃、5%CO2及完全濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，待細胞融合度達到80%~90%時進行細胞傳代。

3.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建MEN1基因敲除的MDA-MB-231 細胞系 使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建MEN1基因敲除的MDA-MB-231 細胞系。利用電轉(zhuǎn)法 將 sgRNA 序 列 （5＇-GGCACCAAATTGGACAGCTCCGG-3＇）轉(zhuǎn)染至 MDA-MB-231 細胞中，挑取單克隆和擴大培養(yǎng)，通過qPCR、基因測序及Western blot 驗證MEN1基因的敲除效率，建立MEN1基因敲除的純合子細胞，命名為MDA-MB-231/KO，MEN1野生型（MDA-MB-231/WT）細胞為對照細胞。純合子克隆號為5D3。

3.4 RT-qPCR 乳腺癌及癌旁組織經(jīng)研磨后按照Trizol 試劑說明書提取總RNA，超微分光光度計測定A值及RNA濃度，A260/A280的比值在1.8~2.0之間表示RNA 純度滿足實驗需求，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA，反應(yīng)條件為 25 °C 5 min；55 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min，合成的 cDNA 置于-80 ℃保存。取2 ng cDNA 進行 qPCR 反應(yīng)，β-actin 上游引物序列為 5’-TCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGA-3’，下游引物序列 為 5’-TTTCTCCATGTCGTCCCAGTTGGT-3’；MEN1上游引物序列為5’-ATCACAGGCACCAAATTGGACAGC-3’，下 游 引 物 序 列 為 5’-AACACTACCCAGGCATGATCCTCA-3’。采用TB Green Premix Ex TaqTMⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System（Bio-rad）進行 RT-qPCR 數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照β-actin校正，實驗重復3次。

3.5 CCK-8 法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231/WT 和 MDA-MB-231/KO 細 胞 使 用0.25%胰蛋白酶溶液進行消化后，以920×g離心5 min，收集細胞，用含10%FBS 的L-15培養(yǎng)液重懸，制備成細胞懸液，按每孔1.5×103個細胞接種至96 孔板，將細胞分為空白對照組和實驗組，每組設(shè)置6 個復孔。同時設(shè)置不加細胞和藥物的調(diào)零孔。將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后加入1μmol/L MNNG、5μmol/L TAM 和0.1μmol/L DOX，按不同實驗要求繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間后進行CCK-8 實驗；吸棄培養(yǎng)液，按每孔 100 μL 的量加入 CCK-8 溶液，終濃度為10%，37 ℃反應(yīng)2 h后，采用多功能酶標儀在450 nm 波長處測量吸光度（A）值，計算各組細胞的相對活力［細胞相對活力（%）=（給藥組A值-調(diào)零孔A值）（/空白對照組A值-調(diào)零孔A值）×100%］；參考文獻［18］采用藥物協(xié)同作用公式計算聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用，q=E（A+B）（/EA+（1-EA）×EB），E（A+B）為藥物聯(lián)合作用的抑制率，其中EA 和EB 分別為單獨藥物作用組的抑制率，q＞1.15為協(xié)同作用，q=0.85~1.15 為相加作用，q＜0.85 為拮抗作用，實驗獨立重復3次。

3.6 克隆形成實驗 將對數(shù)生長期的MDA-MB-231/WT 和MDA-MB-231/KO 細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，細胞以每孔1 500 個接種于含10%FBS的 L-15 培養(yǎng)液的 6 孔板中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 內(nèi)加入 MNNG（1 μmol/L）、TAM（5μmol/L）和DOX（0.1 μmol/L），另加入DMSO 為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)直到觀察到可見的細胞克隆時（約8 d）進行結(jié)晶紫染色；棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌洗3次，甲醇固定 10 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min，結(jié)晶紫染色15 min，自來水清洗，晾干后拍照計數(shù)，實驗重復3次取平均值。

3.7 流式細胞術(shù) 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231/WT和MDA-MB-231/KO細胞（每孔1×104個）接種到6孔 板 中 ，24 h 內(nèi) 加 入 5 μmol/L MNNG 處 理 48 h，DMSO 為對照組；棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗滌 3 次，用無EDTA 的胰酶消化，離心收集細胞，按照Annexin-V/PI 試劑盒說明書操作，先加入500μL 的Binding buffer 重懸細胞，再加入 5 μL FITC 標記的 Annexin-V 和5μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，應(yīng)用流式細胞儀測定細胞凋亡情況；實驗重復3次。

3.8 免疫熒光染色 對數(shù)生長期的MDA-MB-231/WT 和MDA-MB-231/KO 細胞經(jīng)胰酶消化，離心后制備單細胞懸液，取100μL 接種于蓋玻片上制備細胞爬片；24 h 內(nèi)加入 5 mmol/L MNNG 作用 12 h。棄掉培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定 10 min，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；加入 0.1% Triton-X-100 室溫作用10 min，增大細胞膜的通透性；PBS 洗滌 3 次，每次 5 min；加入 5% BSA 室溫封閉 1 h；棄掉1% BSA，加入γH2AX 抗體（1∶200，1% BSA稀釋），53BP1 抗體（1∶200，1% BSA 稀釋）4 ℃過夜。PBS 洗滌3 次，每次5 min，加入熒光標記的Ⅱ抗IgG（1∶200，5%BSA 稀釋），37 ℃避光孵育 1 h；PBS 洗滌3次，每次5 min；加入20μL DAPI染液進行細胞核染色，室溫避光染色10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，滴加20μL抗熒光衰減封片劑，倒扣于載玻片上進行封片，在熒光顯微鏡下觀察和拍照，實驗重復3次。

3.9 免疫組織化學染色組織用4%多聚甲醛固定過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋等制備石蠟切片，切片厚度為5 μm；石蠟切片先用二甲苯脫蠟，梯度乙醇進行復水，10 mmol/L 檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中在高壓鍋中水浴15 min 再冷卻至室溫進行抗原修復；用0.3%過氧化氫孵育10 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，5% BSA 封閉 30 min；孵育Ⅰ抗，4°C 過夜。PBS 洗滌 3 次，每次 5 min 后在室溫下與Ⅱ抗和標記物-HRP 孵育1 h；隨后按照試劑盒說明書進行DAB 染色和蘇木精染色；經(jīng)乙醇脫水、二甲苯玻透明、中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察并拍照，使用DigiLabII-Client 軟件在動態(tài)顯微鏡上采集染色組織的數(shù)字圖像；IHC 染色定量用IMAGE PRO PLUS 軟件計算；同一批次樣品的同一指標使用統(tǒng)一的量化參數(shù)；所有指標均以陽性面積表示，參數(shù)為（H：0~30，S：0~180，I：0~180 或H：0~20，S：0~160，I：0~160）；為了自動量化每個樣本的陽性細胞面積，隨機分析了每個樣本的3 個視野（400 倍放大倍數(shù)，800×600像素），計算每個樣本的平均值；免疫組化全景掃描采用Motic 顯微鏡和MoticDSAssistant Lite軟件。

3.10 Western blot 將MDA-MB-231/WT 和 MDAMB-231/KO 細胞和 MDA-MB-468 細胞消化，離心，收集并重懸，按種至10 cm皿中，將細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；待細胞貼壁后，MDA-MB-231/WT和 MDA-MB-231/KO 細胞用 5 μmol/L MNNG 作用 24 h，以 DMSO 為 對 照組 ；MDA-MB-468 細 胞 用 10μmol/L MI-3作用48 h后再用5μmol/L MNNG單獨和聯(lián)合作用12 h；吸棄培養(yǎng)液，收集細胞，加入RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑），超聲破碎細胞；4 ℃、13 200×g離心10 min，吸取蛋白上清液，用BCA 法測定蛋白濃度，95℃金屬浴中10 min；取30 μg 總蛋白進行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；10%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加入Ⅰ抗menin、γH2AX、RAD51、BRCA1、53BP1、KU70 和 KU80，以Tubulin為內(nèi)參，4 ℃下孵育過夜；TBST漂洗20 min×3次；加入山羊抗兔或山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶5 000），室溫搖床中孵育 1 h；TBST 漂洗 20 min×3 次，使用 ECL 高敏曝光液，于Tanon 成像儀中進行顯影；以ImageJ 軟件測定條帶的灰度值，計算目標蛋白條帶與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值以表示目標蛋白的相對表達量，獨立重復3次實驗。

4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以平均值和標準差（mean±SD）表示，兩組比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 MEN1在乳腺癌組織中高表達

TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示，MEN1在乳腺癌患者癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常人乳腺組織（P＜0.05），見圖1A；根據(jù)乳腺癌的分子分型將其分為惡性程度較低的Luminal 型、中等惡性的HER2+型和高度惡性的TNBC型乳腺癌，分析結(jié)果顯示隨著乳腺癌惡性程度的增加，MEN1的轉(zhuǎn)錄水平隨之增加，其中TNBC型乳腺癌中MEN1的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于Luminal 型和HER2+型（P＜0.05），見圖1B。HE和IHC染色結(jié)果顯示，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中menin 蛋白水平顯著升高（P＜0.01），IHC結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致，見圖1C、D。qPCR 結(jié)果顯示，乳腺癌組織中的MEN1mRNA 水平顯著高于癌旁正常乳腺組織（P＜0.01），見圖1E；Western blot 結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞中的menin 蛋白水平顯著高于MDA-MB-468和MCF-7 細胞（P＜0.01），見圖1F。為了進一步闡明MEN1在乳腺癌惡性表型中的具體作用，本實驗采用Crispr/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 MDA-MB-231/KO 細胞株，并通過瓊脂糖核酸電泳和Western blot 驗證了MEN1的敲除效率，見圖1G~I。

Figure 1. MEN1 is highly expressed in breast cancer tissues. A：transcription level of MEN1 in the normal breast tissues and breast cancer tissues；B：transcription level of MEN1 in normal breast tissues，Luminal，HER2-positive，and triple negative breast cancer（TNBC）tissues；C：HE images，and IHC staining was used to detect the expression of menin in normal breast tissues and breast cancer tissues；D：quantitative analysis of menin IHC staining；E：the mRNA expression of MEN1 in normal breast tissues and breast cancer tissues was detected by using RT-qPCR；F：the expression of menin in MCF-7，MDA-MB-468 and MDA-MB-231 cells was detected by using Western blot and quantified using ImageJ software；G：knockout of MEN1 gene was achieved by using CRSPR/Cas9 technology and verified by sequencing in MDA-MB-231 cell；H：Western blot was used to detect the expression of menin protein in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；I：agarose acid electrophoresis was uesd to verify knockout of MEN1 gene in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；▲▲P＜0.01 vs MDA-MB-231 cells group.圖1 MEN1在乳腺癌組織中高表達

2 MEN1基因敲除抑制乳腺癌細胞惡性表型

與MDA-MB-231/WT 細胞比較，MDA-MB-231/KO 細胞活力明顯受到抑制，隨著時間的延長活力顯著降低（P＜0.05），見圖2A。本實驗進一步研究MEN1基因在乳腺癌細胞對化療藥物DOX、MNNG及TAM 敏感性中的作用，克隆形成結(jié)果顯示，MEN1缺失顯著增強MDA-MB-231細胞對DOX和MNNG的藥物敏感性，且對MNNG的藥物敏感性最高（P＜0.05），但MEN1缺失不影響MDA-MB-231 細胞對TAM 的敏感性（圖2B、C）。EdU 結(jié)果顯示，與 MDA-MB-231/WT 細胞比較，MDA-MB-231/KO 細胞中 EdU 陽性細胞率顯著減少（P＜0.05），DOX 和 MNNG 作用的MDA-MB-231/KO 細胞中EdU 陽性細胞數(shù)顯著低于對照 DMSO組（P＜0.05），MNNG 處理的 MDA-MB-231/KO 細胞的EdU 陽性細胞數(shù)顯著低于DOX 和TAM組細胞（P＜0.05），見圖2D、E。

MI-3 是menin-MLL 復合物的抑制劑，其能破壞menin-MLL 復合物的穩(wěn)定性從而破壞了menin 蛋白的生物學功能。CCK-8 結(jié)果顯示，MI-3 對MDA-MB-231細胞活力的抑制呈濃度依賴效應(yīng)，20%抑制濃度為10 μmol/L（圖2F）；克隆形成結(jié)果顯示，MI-3 顯著抑制MDA-MB-231 細胞的克隆形成能力（P＜0.05），且具有劑量依賴效應(yīng)（圖2G、H）。本實驗采用MI-3單獨作用和聯(lián)合DOX、TAX、TAM、MNNG 作用MDAMB-231 細胞，結(jié)果顯示 MI-3 與 DOX 和 MNNG 聯(lián)合作用能協(xié)同抑制乳腺癌細胞增殖，其中MI-3 與MNNG 的聯(lián)合效果最好（圖 2I）；為了探究 MNNG 是如何增強MI-3 對MDA-MB-231 細胞增殖的抑制作用，我們應(yīng)用MNNG 作用MDA-MB-231/WT 和MDAMB-231/KO 細胞48 h 后運用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，DMSO 處理的MDA-MB-231/WT和MDA-MB-231/KO 細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但MEN1基因敲除顯著增加MNNG 誘導的乳腺癌細胞凋亡（P＜0.05），見圖2J、K。

Figure 2. Knockout of MEN1 gene inhibits malignant phenotype of breast cancer cells. A: CCK-8 assay was used to detect the proliferation activity of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；B：colony formation assay was used to detect the effects of MNNG，TAM and DOX on the clone formation ability of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；C：quantitation of the colony formation number of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with MNNG，TAM and DOX；D：EdU staining was used to detect the effects of MNNG，TAM and DOX on the proliferation of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；E：quantitation of the number of EdU positive cells；F：CCK-8 assay was used to the proliferation of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3 for 72 h；G：colony formation assay was used to detect the colony formation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3；H：quantitation of colony formation number of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of MI-3；I：MI-3 alone or in combination with MNNG，TAX，DOX and TAM for 72 h，the proliferation activity of MDA-MB-231 cells was detected by CCK-8；J：apoptosis of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with 5 mmol/L MNNG for 72 h was detected by flow cytometry；K：quantitation of apoptosis rate of MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs MENI-WT group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 0 μmol/L MI-3 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs alone group.圖2 MEN1基因敲除抑制乳腺癌細胞惡性表型

3 MEN1功能異常誘導DNA損傷累積

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與DMSO 處理組細胞比較，MNNG 作用顯著增加細胞核中γH2AX 的染色，降低DNA 損傷修復因子53BP1 的染色（P＜0.05）；重要的是，MEN1敲除顯著增強 γH2AX 的表達以及促進MNNG 誘導的γH2AX 表達（P＜0.01），同時降低53BP1 的表達以及抑制MNNG 誘導的53BP1的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3A~D。本實驗對16 例乳腺癌組織的石蠟切片進行連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組化檢測menin 和γH2AX 的表達，根據(jù)menin 的表達水平，采用中位數(shù)切割法分為menin 低表達組和menin 高表達組；結(jié)果顯示，menin 高表達的乳腺癌組織中γH2AX 的表達顯著降低（P＜0.05），而menin 低表達的乳腺癌組織中γH2AX 的表達顯著升高（P＜0.05），見圖3E~G。

4 MEN1 敲除抑制同源重組（homologous recombination，HR）修復而促進非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）修復

Western blot 結(jié)果顯示，與 MDA-MB-231/WT 相比，MEN1敲除后 DNA 損傷標志物 γH2AX 表達量增加，同時MEN1缺失促進MNNG誘導的γH2AX表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MNNG 顯著促進激活HR 修復通路相關(guān)因子RAD51、53BP1 以及NHEJ通路關(guān)鍵因子KU70 和KU80 的蛋白表達（P＜0.05）；MEN1基因敲除可顯著抑制 RAD51、BRCA1 及53BP1 的蛋白表達；相反，MEN1缺失促進 KU70 和KU80 的蛋白表達（P＜0.05），見圖4A。本實驗使用MI-3 作用另一株三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468，Western blot 結(jié)果顯示，MI-3 顯著降低 menin 的蛋白表達（P＜0.05）；與MDA-MB-231結(jié)果類似，MI-3顯著抑制 RAD51、BRCA1 及 53BP1 的蛋白表達，促進γH2AX、KU70 及 KU80 的蛋白表達，與 DMSO 處理組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4B。

討 論

乳腺癌已成為嚴重威脅女性健康和生命最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢。TNBC 占所有乳腺癌的9%~16%，好發(fā)于年輕女性［19］。TNBC 侵襲性強，早期復發(fā)率及遠處轉(zhuǎn)移率較高，無病生存率和總生存率較低且預后差［20］。手術(shù)治療、化療和放療是TNBC的常規(guī)治療方法，但“三陰性”的特點使得TNBC 對內(nèi)分泌治療不敏感，是Trastuzumab 靶向治療效果不佳的主要原因。免疫治療、分子靶向治療等新興治療藥物正在緊張的研發(fā)中，真正投入臨床應(yīng)用還需要漫長的時間?；诖耍瑢ふ矣行У姆椒ㄒ越档蚑NBC 的早期復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移、增強其對放療/化療的敏感性對于延長患者無病生存期和降低患者死亡率具有重要的意義。

MEN1基因突變或功能缺失會誘導多發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤如垂體瘤、甲狀旁腺瘤、胰島瘤等的發(fā)生發(fā)展，被證實是一個MEN1 綜合征關(guān)鍵抑癌基因［10-11］；MEN1通過多種機制抑制肺癌細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移［21］。研究顯示menin/MLL 復合物與癌基因YAP1啟動子結(jié)合增加H3K4me3 修飾，促進YAP1基因轉(zhuǎn)錄，從而促進肝細胞肝癌的發(fā)生［22］，表明MEN1基因在不同組織通過不同的分子機制行使促癌或抑癌基因的功能。目前MEN1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用并無一致定論研究報道，女性MEN1 綜合征患者發(fā)生乳腺癌的風險增加，進一步分析顯示這類乳腺癌患者呈MEN1基因的純合缺失，提示MEN1是一個潛在的乳腺癌抑制因子［16］。然而，MEN1基因具有促進散發(fā)性乳腺癌發(fā)生發(fā)展的功能，menin 的過表達參與乳腺癌細胞內(nèi)分泌治療抗性的產(chǎn)生［17］，提示在乳腺癌中MEN1通過不同的機制行使抑癌和促癌的雙重功能。本實驗結(jié)果顯示，MEN1基因在乳腺癌組織和細胞中高表達，提示MEN1在乳腺癌中作為一個潛在促癌基因促進乳腺癌細胞的增殖。為了進一步證實這一結(jié)論，本研究采用CRSPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建MEN1基因敲除的三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，CCK-8和克隆形成實驗結(jié)果顯示，MEN1基因敲除顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖和克隆形成能力，表明MEN1基因是一個乳腺癌促進因子。此外，我們采用menin/MLL 復合物抑制劑 MI-3 作用 MDA-MB-231 細胞后，通過 CCK-8、克隆形成實驗和EdU染色均觀察到MI-3顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，提示menin/MLL 復合物是menin 行使促乳腺癌功能所必須，其詳細的分子機制需要進一步研究。

Figure 3. Knockout of MEN1 gene induces DNA damage accumulation. A：the expression of γH2AX was detected by using immunofluorescence staining in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated by MNNG for 24 h；B：immunofluorescence staining was used to detect the expression of 53BP1 in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated by MNNG for 24 h；C：quantitation of γH2AX expression in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；D：quantitation of 53BP1 expression in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells；E：HE images of breast cancer tissues and IHC staining was used to detect the expression of menin and γH2AX proteins in breast cancer tissues；F：quantitation of meninlevels in breast cancer tissues；G：quantitation of γH2AX levels in breast cancer tissues. Mean±SD.**P＜0.01 vs MEN1-WT group；△△P＜0.01 vs menin-high group.圖3 MEN1基因敲除誘導DNA損傷累積

本研究結(jié)果顯示，MEN1基因敲除不影響MDAMB-231 細胞凋亡，但顯著促進DNA 損傷誘導劑MNNG誘導的細胞凋亡，表明在正常情況下MEN1基因不能啟動乳腺癌細胞的凋亡通路，但MEN1缺失能增強由外界刺激啟動的細胞凋亡，推測MEN1促進乳腺癌細胞增殖可能與細胞凋亡通路的失活無關(guān)。有趣的是，MEN1基因敲除能增強乳腺癌細胞對DNA 損傷誘導劑MNNG 的敏感性，而不影響乳腺癌細胞對雌激素藥物他莫昔芬的敏感性。普遍認為，傳統(tǒng)放化療藥物通過誘導不可修復的DNA 損傷，主要以DNA 雙鏈斷裂為主從而殺死腫瘤細胞，增強放化療的治療效果［23］；MNNG 作為一種 DNA 損傷誘導劑，能誘導DNA 堿基突變，抑制宮頸癌細胞增殖［24］。我們推測，MEN1缺失抑制DNA 修復通路，導致?lián)p傷的DNA 在乳腺癌細胞中累積從而誘導細胞死亡。研究報道，menin與DNA損傷修復因子FANCD2結(jié)合有利于同源重組介導DNA 雙鏈斷裂修復［25］。在黑色素瘤細胞中的研究表明menin/MLL 復合物與HR修復因子RAD51C的啟動子結(jié)合，增加H3K4me3 的修飾，促進RAD51C的表達從而抑制黑色素瘤細胞的增殖［26］。本研究結(jié)果顯示，MEN1缺失抑制 HR 修復因子 RAD51、BRCA1 及 53BP1 的蛋白表達，誘導DNA損傷標志物γH2AX的表達；有趣的是，MEN1敲除反而激活非同源末端連接通路（標志物為KU70和KU80），與 Qiu 等［27］在肺癌細胞中報道的結(jié)果一致。NHEJ 介導的DNA 損傷修復會導致遺傳信息的丟失，是物種多樣性和自然選擇主要原因，NHEJ 作為一種非保真易錯的DNA 損傷修復容易引起DNA 損傷累積［28］。本研究結(jié)果表明，MEN1作為一個重要的DNA 損傷修復因子，其功能失活抑制HR 介導的DNA 損傷精準修復，激活NHEJ 介導的易錯修復通路，導致DNA 損傷累積，從而增強乳腺癌細胞對放化療藥物的敏感性。本研究為以menin 及其調(diào)控的DNA 修復通路關(guān)鍵基因為靶點開發(fā)乳腺癌放化療增敏劑提供了實驗依據(jù)。

Figure 4. Knockout of MEN1 gene inhibits homologous recombination repair and promotes non-homologous terminal junction repair.A：Western blot was used to detect the expression of γH2AX，RAD51，BRCA1，KU70，KU80 and 53BP1 proteins in MDA-MB-231/WT and MDA-MB-231/KO cells treated with 5 mmol/L MNNG for 24 h；B：Western blot was used to detect the expression of γH2AX，RAD51，BRCA1，KU70，KU80 and 53BP1 proteins in MDA-MB-468 cells treated with 10μmol/L MNNG for 48 h. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs WT group；△△P＜0.01 vs DMSO group；##P＜0.01 vs MNNG group.圖4 MEN1敲除抑制同源重組修復而促進非同源末端連接修復