基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究知母-黃柏藥對(duì)抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)

蘇 萌，譚福雄，呂 潔，雷莉妍*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽(yáng) 712083；2西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，西安 710000

炎癥是機(jī)體受到創(chuàng)傷后感染或自身免疫損傷時(shí)產(chǎn)生的一種可溶性因子與細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用[1]。炎癥的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，病毒、細(xì)菌和真菌等病原體入侵都會(huì)誘發(fā)機(jī)體炎癥[2]。炎癥一旦產(chǎn)生，可能誘發(fā)嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)后果。研究顯示，慢性或頻繁的炎癥可以誘發(fā)癌癥及自身免疫性疾病[3]。

藥對(duì)是介于單味藥和復(fù)方之間的配伍單元，既具有復(fù)方靈活加減的特性，又具有單味中藥化學(xué)成分相對(duì)簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[4]。知母-黃柏藥對(duì)出自《蘭室秘藏》，具有滋陰清熱、瀉火解毒的功效，主治陰虛火旺等癥[5]。知母-黃柏藥對(duì)在臨床上為常見(jiàn)藥對(duì)，多個(gè)方劑及中成藥都包含該配伍，研究表明該藥對(duì)或包含該藥對(duì)的方劑有一定的抗炎作用。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn)知柏地黃丸可以調(diào)節(jié)炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)損傷的愈合。Zuo等[7]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)，包含知母-黃柏的三花湯加減方治療慢性前列腺炎108例，有效率可達(dá)83.5%。并且有現(xiàn)代藥理研究顯示，知母-黃柏藥對(duì)對(duì)慢性前列腺炎也有顯著的治療作用[8]。本課題組前期研究顯示，知母-黃柏藥對(duì)水提液的30%乙醇洗脫部位在細(xì)胞水平有顯著的抗炎作用[9]。為了進(jìn)一步探討知母-黃柏的抗炎機(jī)制，本研究擬先通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)知母-黃柏的抗炎機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行驗(yàn)證。本研究將為知母-黃柏藥對(duì)的臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

知母飲片(批號(hào)：20200301)、黃柏飲片(批號(hào)：20200301)購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格為1.0 kg；脫水淫羊藿素購(gòu)于北京索萊寶公司(批號(hào)：412B022，純度98%)。

1.2 細(xì)胞

小鼠RAW 264.7細(xì)胞(編號(hào)：3131C0001000800 013)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：2121143)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(批號(hào)：1903320)購(gòu)于以色列Biological Industries公司；青-鏈霉素(批號(hào)：0010419)購(gòu)于以色列Biological Industries公司；IL-6、TNF-αELISA試劑盒(批號(hào)：M201210-004a，M201210-102a)購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司；細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜(批號(hào)：710N0310)購(gòu)于北京索萊寶公司；無(wú)水乙醇(批號(hào)：20210508)購(gòu)于天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器

311型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；Thermo Multi-skan GO多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；DSZ2000X型倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)；Agilent 1290型高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX 4500 Qtrap三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司，美國(guó)AB SCIEX公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(Sartorius科學(xué)儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 知母-黃柏藥對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接分析

1.5.1.1 知母-黃柏活性成分及靶點(diǎn)收集篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/index.php)分別搜索知母、黃柏的化學(xué)成分，按照生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的原則對(duì)各化合物進(jìn)行篩選[10]。在TCMSP平臺(tái)篩選各活性成分的靶點(diǎn)。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將得到的活性成分靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)。

1.5.1.2 炎癥靶點(diǎn)收集及篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“inflammation”為關(guān)鍵詞檢索，得到炎癥相關(guān)的靶基因，去重復(fù)值后以“相關(guān)性得分”≥10進(jìn)行篩選。借助于jvenn在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)繪制韋恩圖，將知母-黃柏的靶基因與炎癥靶基因相互映射，得到知母-黃柏干預(yù)炎癥的潛在靶基因。

1.5.1.3 構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)

將知母-黃柏干預(yù)炎癥的靶基因和炎癥相關(guān)的靶基因?qū)隤erl語(yǔ)言中，得到網(wǎng)絡(luò)連線信息和節(jié)點(diǎn)類(lèi)型等信息文件，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件的插件cytohubba，分別根據(jù)degree值和最大集團(tuán)中心度(maximal clique centrality，MCC)值篩選出前10個(gè)節(jié)點(diǎn)。

1.5.1.4 構(gòu)建知母-黃柏干預(yù)炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)

為了直觀地了解知母-黃柏干預(yù)炎癥的潛在靶蛋白之間的相互作用，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)導(dǎo)入靶基因，選擇物種為人(homo sapiens)，得到知母-黃柏干預(yù)炎癥靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖及對(duì)應(yīng)信息，隱藏?zé)o關(guān)的靶蛋白。將得到的信息導(dǎo)入R語(yǔ)言中，利用腳本得到前10個(gè)出現(xiàn)次數(shù)最多的靶點(diǎn)柱狀圖。

1.5.1.5 知母-黃柏干預(yù)炎癥靶基因的功能和通路分析

為進(jìn)一步探究知母-黃柏干預(yù)炎癥靶點(diǎn)的相關(guān)功能和涉及的通路，本研究使用R語(yǔ)言BiocManager包將靶基因名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為基因ID，在此基礎(chǔ)上，再使用R語(yǔ)言的bioconductor包、DOSE包等程序包，得到相應(yīng)基因ID的功能和通路。

1.5.1.6 知母-黃柏活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

利用“1.5.1.3”得到的3個(gè)化學(xué)成分和7個(gè)靶點(diǎn)，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載知母-黃柏3個(gè)核心化學(xué)成分的2D結(jié)構(gòu)，并保存為*mol格式，利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)搜索7個(gè)“Homo Sapiens”的核心靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，下載其3D結(jié)構(gòu)并保存為*sdf格式。借助分子對(duì)接軟件sybyl V2.1.1進(jìn)行修復(fù)殘基、加氫、構(gòu)建活性口袋、Surflex-Dock對(duì)接，導(dǎo)出*PDB格式。最后，通過(guò)pymol V2.4.0進(jìn)行可視化處理。

1.5.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測(cè)定

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，洗脫梯度：0～60 min，5%→99% B；65 min，99%→5% B；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

1.5.2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，檢測(cè)模式為多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。離子化參數(shù)為離子噴霧電壓，負(fù)離子模式-4 500 V；霧化氣和輔助氣為氮?dú)?；離子源溫度550 ℃，輔助氣GS1、GS2溫度為60 ℃，氣簾氣溫度35 ℃；離子掃描范圍：100～1 000 Da；掃描速率：200 Da/s；合物離子對(duì)，優(yōu)化后的采集參數(shù)：去簇電壓(DP)為134.34 V、碎裂能量(CE)為-35.03 eV和碰撞池出口電壓(CXP)為-9.11 V。

1.5.2.3 供試品的制備

精密稱(chēng)取知母、黃柏各30 g，加300 mL水，浸泡30 min，小火煮沸，并保持微沸煎煮1 h。倒出水煎液，加240 mL水，微沸煎煮1 h，合并兩次濾液并濃縮為浸膏，保存于-20 ℃冰箱，備用。精密稱(chēng)取10 mg，加入1 mL甲醇，超聲20 min，混勻后靜置，取上清，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進(jìn)樣量為5 μL。

1.5.2.4 對(duì)照品的制備

精密稱(chēng)取脫水淫羊藿素0.62 mg,加入1 mL甲醇，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液用甲醇稀釋100倍，進(jìn)樣量為5 μL。

1.5.3 知母-黃柏藥對(duì)抗炎活性檢測(cè)

1.5.3.1 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.3.2 藥物配制及實(shí)驗(yàn)分組

稱(chēng)取適量知母-黃柏藥對(duì)浸膏，用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配為2 mg/mL母液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

脫水淫羊藿素用細(xì)胞級(jí)二甲基亞砜(DMSO)配成10 mM儲(chǔ)液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果對(duì)知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)藥物設(shè)置空白組、模型組(即1 μg/mL LPS)、藥物不同濃度處理組。知母-黃柏藥物低、中、高不同濃度為5、7.5、10 μg/mL，脫水淫羊藿給藥低、中、高不同濃度組為2.5、5、7.5 μmol/L。

1.5.3.3 細(xì)胞相對(duì)存活力檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，用不同濃度藥物預(yù)處理細(xì)胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度值。

1.5.3.4 NO及炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后，用不同濃度各藥物預(yù)處理細(xì)胞1 h，每孔加入終濃度為1 μg/mL LPS，空白組加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。藥物處理20 h，收集各孔細(xì)胞上清，12 000 r/min離心15 min，取上清。采用Griess法測(cè)NO生成水平，ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6分泌水平。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果

2.1.1 知母-黃柏藥對(duì)活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18篩選后得到52個(gè)活性成分，其中知母15個(gè)，黃柏37個(gè)(見(jiàn)表1)。該52個(gè)活性成分在TCMSP中共檢索到619個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)對(duì)應(yīng)名稱(chēng)并去重復(fù)可得102個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 知母-黃柏化學(xué)成分基本信息

2.1.2 炎癥的靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過(guò)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)查找到有關(guān)炎癥的靶點(diǎn)共10 272個(gè)，通過(guò)去除重復(fù)值并以大于等于10分進(jìn)行篩選，最終得到538個(gè)疾病靶基因。使用jevnn在線工具得到知母-黃柏干預(yù)炎癥的潛在靶基因22個(gè)(見(jiàn)圖1)。

圖1 知母-黃柏干預(yù)炎癥的靶基因

2.1.3 構(gòu)建藥物-炎癥-靶基因可視化網(wǎng)絡(luò)

以篩選出核心化合物及核心靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，得到藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖，包含53個(gè)節(jié)點(diǎn)，106個(gè)邊(見(jiàn)圖2)。以degree與MCC同時(shí)滿(mǎn)足篩選出前10個(gè)活性較高的化學(xué)成分和靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，degree、MCC結(jié)果相同(見(jiàn)圖3)，得到3個(gè)化學(xué)成分，分別為quercetin(槲皮素)、anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)、β-sitosterd(β-谷甾醇)，7個(gè)靶點(diǎn)分別為VEGFA、RELA、PPARG、PRSS1、PTGS1、CASP3。

圖2 藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 重要活性成分-靶標(biāo)圖

2.1.4 構(gòu)建知母-黃柏干預(yù)炎癥的互作網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步分析知母-黃柏抗炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并隱藏與其他蛋白無(wú)關(guān)的靶蛋白后，得到知母-黃柏干預(yù)炎癥的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖4)。通過(guò)R語(yǔ)言處理得到前10個(gè)互作次數(shù)最多靶點(diǎn)柱狀圖(見(jiàn)圖5)。由圖可以看出，知母-黃柏干預(yù)炎癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)與IL-6、VEGFA、CASP3、PPARG等密切相關(guān)。

圖4 知母-黃柏干預(yù)炎癥的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 互作次數(shù)多的靶點(diǎn)柱狀圖(前10個(gè))

2.1.5 知母-黃柏干預(yù)炎癥靶基因GO及KEGG分析結(jié)果

用R語(yǔ)言腳本處理知母-黃柏干預(yù)炎癥的22個(gè)靶基因后得到63個(gè)GO富集相關(guān)的功能(見(jiàn)圖6)，83個(gè)KEGG富集的通路(見(jiàn)圖7)，根據(jù)P<0.01選擇發(fā)現(xiàn)GO為30個(gè)，KEGG為66個(gè)。篩選GO和KEGG各前20個(gè)進(jìn)行條目分析。GO分析結(jié)果顯示，知母-黃柏治療炎癥靶點(diǎn)主要功能包括：激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過(guò)程、轉(zhuǎn)錄因子活性等。通過(guò)KEGG富集分析后，發(fā)現(xiàn)知母-黃柏主要通過(guò)與TNF信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化及卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號(hào)通路發(fā)揮作用。

圖6 知母-黃柏干預(yù)炎癥靶基因的GO功能富集分析

圖7 知母-黃柏干預(yù)炎癥靶基因的KEGG通路富集分析

2.1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

利用Degree及MCC結(jié)果得到3個(gè)活性較高的化學(xué)成分和7個(gè)主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，其中RELA未找到對(duì)應(yīng)唯一受體蛋白，故不納入。分子對(duì)接結(jié)果如表2顯示，脫水淫羊藿素與PPARG結(jié)合作用打分最高，β-谷甾醇、槲皮素均與靶點(diǎn)NR3C1結(jié)合作用最強(qiáng)。選取上述3個(gè)成分與其打分最高的蛋白分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見(jiàn)圖8)。

表2 分子對(duì)接結(jié)果

圖8 核心成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果圖

2.2 知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量測(cè)定結(jié)果

含量測(cè)定結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為48.91 min，知母-黃柏藥對(duì)中脫水淫羊藿素保留時(shí)間為49.25 min，經(jīng)計(jì)算知母-黃柏藥對(duì)中脫水淫羊藿素含量為18.04%(見(jiàn)圖9)。

圖9 知母-黃柏中脫水淫羊藿含量測(cè)定

2.3 知母-黃柏藥對(duì)抗炎活性

2.3.1 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響

模型組與空白組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低；與模型組比較，各藥物均可不同程度的保護(hù)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其中脫水淫羊藿素高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表3)。

表3 各組RAW 264.7細(xì)胞存活率比較

2.3.2 知母-黃柏及脫水淫羊藿素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO、IL-6、TNF-α含量影響

與空白組比較，模型組NO、IL-6、TNF-α含量水平均顯著升高；與模型組比較，各藥物干預(yù)組不同程度降低NO、IL-6、TNF-α水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 各組NO、TNF-α、IL-6含量水平比較

3 討論與結(jié)論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)知母-黃柏有顯著的抗炎作用，為了探討其抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制，本研究首先通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出知母-黃柏抗炎的核心化學(xué)成分槲皮素、β-谷甾醇和脫水淫羊藿素。有研究顯示，槲皮素可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制小鼠RAW 264.7細(xì)胞炎癥，還可通過(guò)抑制NF-κB的表達(dá)有效地減輕人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥因子[10,11]。β-谷甾醇對(duì)啤酒中酵母誘導(dǎo)的大鼠發(fā)熱有良好的抗炎活性[12]。脫水淫羊藿素對(duì)酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎具有顯著的保護(hù)作用，該作用可能與其抑制巨噬細(xì)胞鈣離子內(nèi)流及iNOS表達(dá)有關(guān)[13]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素與PPARG、β-谷甾醇和槲皮素均與NR3C1結(jié)合有較高的結(jié)合活性，其中脫水淫羊藿素與PPARG對(duì)接結(jié)果打分最高。這提示，脫水淫羊藿素可能是知母-黃柏抗炎的主要活性成分。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的預(yù)測(cè)結(jié)果提示下，本研究檢測(cè)了知母-黃柏中脫水淫羊藿素的含量。結(jié)果顯示，脫水淫羊藿素在知母-黃柏中含量為18.04%。為進(jìn)一步探究知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎活性及可能作用機(jī)制，我們?cè)诩?xì)胞水平研究了知母-黃柏及脫水淫羊藿素對(duì)相關(guān)炎癥因子生成的影響。結(jié)果表明，知母-黃柏及脫水淫羊藿素能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、NO生成。TNF信號(hào)通路是KEGG預(yù)測(cè)的知母-黃柏發(fā)揮抗炎作用最主要的通路。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)之一，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體是核受體超家族的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究表明，TNF-α能抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ)活性，降低PPARγ的表達(dá)，并進(jìn)一步以PPARγ依賴(lài)的方式活化NF-κB通路[14-16]，NF-κB會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)下游炎癥相關(guān)基因如IL-6、iNOS等的表達(dá)[17,18]，而NO為iNOS催化產(chǎn)生[19]。因此，本研究推測(cè)知母-黃柏通過(guò)TNF通路抗炎是其重要機(jī)制之一。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選知母-黃柏抗炎的成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路，利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證脫水淫羊藿素與核心靶點(diǎn)結(jié)合能力，并通過(guò)含量測(cè)定驗(yàn)證知母-黃柏中脫水淫羊藿素含量，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證知母-黃柏及脫水淫羊藿素的抗炎作用，并對(duì)其抗炎的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。本研究為藥物干預(yù)疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制研究提供了可借鑒的方法，為臨床知母-黃柏用藥提供了研究基礎(chǔ)。