利用SSR創(chuàng)建中國(guó)北方黍稷資源DNA身份證

胡玉璐，姜百靈，陳 凌，王海崗，曹曉寧，王瑞云，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

黍稷，又名為黍（Panicum miliaceumL.），是我國(guó)傳統(tǒng)的糧食作物，抗旱能力極強(qiáng)，適宜栽種在干旱以及半干旱地區(qū)，在我國(guó)的北方尤其在西北地區(qū)非常適宜種植[1-3]。黍稷的栽種在我國(guó)旱作農(nóng)業(yè)、鹽堿地的開(kāi)發(fā)利用和救災(zāi)補(bǔ)種中，發(fā)揮著十分重要的作用[4]。黍稷具有上萬(wàn)年的栽培歷史，多篇?dú)v史文獻(xiàn)資料曾記載黍稷栽種在我國(guó)發(fā)展上的重要性[5-6]。在當(dāng)今日益追求健康飲食的社會(huì)生活中，雜糧因其膳食纖維豐富等原因倍受追崇，黍稷作為五谷雜糧之一，其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，不僅含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)元素等人體基本營(yíng)養(yǎng)素，且這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)素含量普遍高于小麥、大米等我們較常食用的谷類(lèi)[7-8]。在近些年的研究中，人們認(rèn)識(shí)到黍稷具有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，也能達(dá)到一定的保健功效，是較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠、安全、有療效的食療食品，其開(kāi)發(fā)的前景十分廣闊[9]。

SSR（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）分子標(biāo)記法具有分布均勻、數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、技術(shù)相對(duì)完善等優(yōu)點(diǎn)，主要在物種的基因型鑒定與品種保護(hù)、種子的純度評(píng)價(jià)和種質(zhì)保存、分子標(biāo)記輔助選擇育種、資源鑒定等領(lǐng)域中應(yīng)用。SSR標(biāo)記也是目前應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記技術(shù)[10]，在花生[11]、花椰菜[12]、棉花[13]、高粱[14]等多種作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析中應(yīng)用。SSR標(biāo)記也能從DNA水平直接鑒定出品種之間的遺傳差異[15]。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）利用SSR和SNP（Single nucleotide polymorphism，單核酸多態(tài)性）作為分子標(biāo)記構(gòu)建作物品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)[16]。SSR標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，具有的高通量、高精度、高效率等優(yōu)點(diǎn)，可用于大量材料的檢測(cè)評(píng)定，在大豆[17]、玉米[18]、小麥[19]、水稻[20]、柑橘[21]、菜豆[22]等作物品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用。DNA條形碼就是基于在SSR分子標(biāo)記技術(shù)，將種間基因水平差異用數(shù)字轉(zhuǎn)化成條形碼的形式，使品種有一個(gè)由特定數(shù)字組成的代碼，對(duì)種質(zhì)資源的知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)和管理具有重要作用[23-25]。DNA條形碼自2003年首次提出后，已在糧食作物（小麥和玉米等）、水果（蘋(píng)果和桃等）和油料作物（芝麻、花生等）中廣泛應(yīng)用，使資源實(shí)現(xiàn)了數(shù)字化和網(wǎng)絡(luò)化管理。

我國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)已有黍稷資源9 885份，地方品種占99.4%，育成品種占0.6%，種質(zhì)資源豐富，對(duì)黍稷資源的開(kāi)發(fā)利用具有重大意義[26]。由于黍稷新資源的不斷采集和引進(jìn)，種質(zhì)資源的交流越來(lái)越頻繁，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品品種、良種、地方品種和野生品種之間出現(xiàn)大量的同源異義現(xiàn)象，農(nóng)家品種流通不足，無(wú)法發(fā)揮出優(yōu)良品種的最大價(jià)值，造成種質(zhì)資源嚴(yán)重浪費(fèi)，極大地影響了資源的采集和整理效率[27]。因此，創(chuàng)建準(zhǔn)確可靠且操作便捷的資源鑒定系統(tǒng)勢(shì)在必行，需為黍稷品種制定一份專(zhuān)屬的DNA分子身份證，以便更好的開(kāi)發(fā)和利用黍稷種質(zhì)資源[28]。在目前研究中，已有陸徐忠等[29]從48對(duì)SSR熒光引物中篩選出12對(duì)作為核心引物，構(gòu)建了安徽省水稻品種127個(gè)分子指紋圖譜。侯麗媛等[30]從16對(duì)熒光SSR引物中篩選出7對(duì)引物，構(gòu)建了包括蘋(píng)果新品種赤霞在內(nèi)的20個(gè)品種的分子識(shí)別卡。黍稷作為一種小雜糧，其分子身份證的構(gòu)建報(bào)道極少。將條形碼引入黍稷資源管理，編輯黍稷資源信息，使其具有特定的數(shù)字編碼，可以解決目前存在的問(wèn)題，有助于保護(hù)種質(zhì)資源的知識(shí)產(chǎn)權(quán)[31-33]。

本研究采用SSR分子標(biāo)記法，選取中國(guó)北方具有代表性的20份黍稷材料，利用14對(duì)高基元引物，擬構(gòu)建20份黍稷資源的分子身份證，為黍稷資源的高效分類(lèi)和應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用中國(guó)北方大部分地區(qū)20份有顯著差異的黍稷材料，山西?。?份）、陜西?。?份）、黑龍江（1份）、內(nèi)蒙古（4份）、河南（1份）、寧夏（3份）、甘肅?。?份）、和青海?。?份）8個(gè)省共20份黍稷資源進(jìn)行種植，于三葉期取葉片0.3 g，液氮速凍保存至-80℃冰箱。20份材料如表1所示。

1.2 試劑和儀器

試劑：氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇瓊脂糖、0.5×TBE電泳緩沖液、6×DNA loading buffer、dd H2O、2×TaqPCR MasterMix含染料、30%的丙烯酰胺、TBE電泳緩沖液、過(guò)硫酸銨、TEMED、50 bp Marker、AgNO3、Na OH、甲醛CTAB裂解液。

儀器：離心機(jī)、冰箱、BIO-GENER、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、高壓滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀、渦旋儀、Nanodrop ND-1000核酸濃度檢測(cè)儀、微波爐、瓊脂糖凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像儀、移液槍。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取和檢測(cè) 剪取三葉期葉片，采用改良CTAB法[34]提取基因組DNA。利用NanodropND-1000核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)DNA的完整性[35]。

表1 20份黍稷試驗(yàn)材料Tab.1 The detail of 20 broomcorn millet accessions in this experiment

1.3.2 引物篩選、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 用14對(duì)高基元引物（表2）擴(kuò)增地理來(lái)源差異較大的20份黍稷資源，篩選條帶清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物用于構(gòu)建分子身份證。20μL PCR體系含10μL 2×MasterMix（中 科 瑞 泰2×Taq PCR MasterMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)?4℃4 min；94℃40 s，退火溫度40 s，72℃1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃8 min[28]。

表2 SSR引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的基因組數(shù)據(jù)，有條帶讀“1”，無(wú)條帶讀“0”。用PowerMarker 3.25[36]軟件計(jì)算每個(gè)引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），用PopGen 1.32[37]計(jì)算不同樣品間的Nei's遺傳距離。利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開(kāi)發(fā)的ID Analysis 4.0軟件建立分子身份證。輸入相應(yīng)的字符串并使用聯(lián)機(jī)條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）產(chǎn)生DNA條形碼；黍稷種質(zhì)基本信息及身份證通過(guò)在線(xiàn)二維碼輸入技術(shù)（https://cli.im/）產(chǎn)生相應(yīng)的DNA二維碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)SSR的引物篩選結(jié)果

從北方黍稷栽培區(qū)選取黍稷材料共20份，對(duì)五、六堿基引物共14對(duì)SSR引物篩選，結(jié)果表明，材料相似系數(shù)為0.8，缺失引物占比為50%。其中,有4對(duì)引物與其他引物相似系數(shù)過(guò)高，被剔除。10對(duì)引物能夠擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物，可用于分子身份證的構(gòu)建的核心引物。

2.2 引物多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

用10對(duì)引物對(duì)20份黍稷種質(zhì)進(jìn)行了擴(kuò)增。由表3可知，在20份材料的10個(gè)基因座中檢測(cè)到30個(gè)等位基因，每個(gè)基因座中檢測(cè)到3個(gè)等位基因（平均3.000 0）；有效等位變異（Na）為1.662 3（RYW7）~2.792 3（RYW12），平均為2.455 3；Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.702 9（RYW7）~1.088 0（RYW2），平均值為0.958 8；雜合度（Ho）為0.500 0（RYW7）~0.823 5（RYW12），平均值為0.686 6；期望雜合度（He）為0.411 3（RYW7）~0.686 2（RYW2），平均 值為0.602 4；Nei's的基因多樣性指數(shù)（Nei）為0.398 4（RYW7）~0.659 8（RYW2），平均值為0.582 8；多態(tài)信息含量（PIC）在0.488 6（RYW3）~0.776 6（RYW8），平均值為0.629 8。

表3 10個(gè)SSR的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of 10 SSR markers

2.3 北方栽培區(qū)黍稷的DNA分子身份證構(gòu)建

本試驗(yàn)采用多個(gè)引物的等位基因組合來(lái)劃分品種，獲得分子身份證的引物為RYW10、RYW6、RYW7、RYW5、RYW1、RYW2、RYW8和RYW3共8對(duì)引物可將全部黍稷材料區(qū)分開(kāi)來(lái)。將10對(duì)引物用排列組合方式構(gòu)建DNA分子身份證的即字符串DNA分子身份證。各品種詳細(xì)編碼如表4所示，最終獲得各品種的二維碼和條形碼表示其DNA分子身份證（圖1）。以表4中編號(hào)1材料為例，其字符串DNA分子身份證為10111110，表示在上述引物順序下材料1中在引物RYW10顯示有條帶、RYW6顯示無(wú)條帶、RYW7顯示有條帶，依次類(lèi)推，到引物RYW3無(wú)條帶，即黍稷材料1的字符串DNA分子身份。

表4 20份黍稷資源的分子身份證編碼Tab.4 Code of molecular ID of 20 broomcorn millet resources

3 討論

3.1 SSR遺傳多樣性衡量參數(shù)

黍稷是一種遺傳變異多樣的古老作物，已有大量相關(guān)研究。前人研究表明，黍稷基因多樣性指數(shù)分別為0.736 0、0.768 6、0.628 4、0.841 5、0.847 8和0.859 9，多態(tài)性信息含量分別為0.554 4、0.457 3、0.427 9、0.587 4、0.471 4和0.566 7[25-26，35，38-40]。本研究對(duì)8個(gè)省的黍稷材料進(jìn)行了分析，數(shù)據(jù)在其范圍中。

3.2 DNA指紋圖譜和分子身份證編碼

DNA指紋是一種通過(guò)比較電泳指紋的差異來(lái)區(qū)分生物個(gè)體差異的方法。然而，由于DNA指紋圖譜條帶多，人工比對(duì)和解釋費(fèi)時(shí)費(fèi)力，統(tǒng)計(jì)分析繁瑣，限制了大規(guī)模物種鑒定的應(yīng)用。DNA分子身份證是以前者為基礎(chǔ)，采用不同的編碼方法對(duì)電泳圖進(jìn)行數(shù)字化，得到字符串結(jié)果，并輔以條形碼、二維碼等科學(xué)的表示方法，使品種比對(duì)更加高效、方便、準(zhǔn)確，克服了手工比對(duì)指紋繁瑣、效率低下的缺點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于品種鑒定。以往的研究利用SSR標(biāo)記構(gòu)建品種的分子識(shí)別卡，常用的編碼方法有以下3種：0/1編碼型，根據(jù)電泳條帶有無(wú)，賦值1或0，形成0和1串[41]。等位基因分配編碼型，編碼擴(kuò)增的等位基因[42]?；蛐捅恢付榫幋a類(lèi)型，引物擴(kuò)增的條帶被編碼[24]。本研究采用第1種凝膠電泳法進(jìn)行編碼，具有編寫(xiě)簡(jiǎn)單、統(tǒng)計(jì)方便、字長(zhǎng)適中、檢索方便等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 PAGE銀染法構(gòu)建DNA分子身份證的可行性研究

到目前為止，檢測(cè)SSR標(biāo)記的方法主要有2種，即PAGE銀染法和熒光毛細(xì)管電泳法。楊文娟等[43]用這2種方法檢測(cè)了131份應(yīng)用核心種質(zhì)，PAGE銀染法所得數(shù)據(jù)與毛細(xì)管電泳結(jié)果基本一致。另外，許多研究者對(duì)此進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)PAGE方法是肯定的。另外，常規(guī)變性PAGE銀染法不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，試劑成本低，適合于少量物質(zhì)的分析。普通引物可以保存3~5 a，而熒光標(biāo)記引物只能保存1~2 a，因此后者的合成成本遠(yuǎn)高于前者。因此，在引物質(zhì)量可靠、試驗(yàn)材料少、經(jīng)濟(jì)條件有限的前提下，采用PAGE銀染法構(gòu)建DNA分子身份證是可行的。

3.4 用高堿度引物構(gòu)建分子身份證

過(guò)去，低基元的SSR被用來(lái)構(gòu)建資源的分子身份證。張嘉等[44]從111對(duì)引物中篩選出29對(duì)SSR核心引物，最終用4對(duì)雙堿基引物構(gòu)建了66個(gè)中國(guó)芍藥分子識(shí)別卡。郭艷春等[45]結(jié)合高、低堿基引物構(gòu)建分子身份證，用12對(duì)熒光SSR引物組合（1、4、4、1、2對(duì)單堿基、二堿基、三堿基、四堿基和五堿基）構(gòu)建了61張黃麻核心種質(zhì)分子身份證。本研究用8對(duì)高堿基（4堿基重復(fù)基序）引物檢測(cè)了2個(gè)遺傳多樣性參數(shù)指標(biāo)，即基因多樣性指數(shù)1.043 7和多態(tài)性信息含量0.690 5，均高于低堿基[25，46]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在14對(duì)SSR引物中篩選出10對(duì)適宜堿基引物對(duì)北方地區(qū)的20份黍稷種質(zhì)進(jìn)行鑒定，將北方地區(qū)的黍稷種質(zhì)品種及其近緣野生種和育成品種的信息資料進(jìn)行分類(lèi)匯總，構(gòu)建了20份糜子種質(zhì)的條形碼DNA分子身份證和二維碼DNA分子身份證。