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    伴BCOR/BCORL1突變的髓系腫瘤共突變基因表達(dá)譜及病理參數(shù)分析*

    2022-05-06 02:11:34李佳張春玲楊雋李鶴王小蕊
    臨床檢驗雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:髓系中位基因突變

    李佳,張春玲,楊雋,李鶴,王小蕊

    (上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院a.檢驗醫(yī)學(xué)中心,b.血液科,上海 200080)

    B細(xì)胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 corepressor,BCOR)位于X染色體Xp11.4,共包含15個外顯子。BCORL1(BCL6 Corepressor like 1)是BCOR同源基因,位于X染色體Xq26.1,共包含12個外顯子。 研究發(fā)現(xiàn),BCOR/BCORL1參與骨髓細(xì)胞的增殖與分化,在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控過程中起重要作用[1]。BCOR/BCORL1突變常見于骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)等髓系腫瘤,可檢測到的突變類型包括小片段插入缺失、移碼突變、無義突變和剪切位點突變等。多項研究證實,伴BCOR/BCORL1突變的髓系腫瘤患者預(yù)后不良,且這些患者的病理參數(shù)存在一定差異[2-4]。然而,與BCOR/BCORL1突變同時存在的其他共突變基因是否會引起患者臨床病理參數(shù)差異,其突變位置和治療方案是否影響患者預(yù)后,國內(nèi)外尚無相關(guān)文獻(xiàn)支持。本次研究利用高通量測序技術(shù),回顧性分析本中心伴BCOR/BCORL1突變的髓系腫瘤患者的共突變基因表達(dá)譜及其臨床病理參數(shù),以期為臨床治療此類突變患者及預(yù)后評估提供依據(jù)。

    1 對象與方法

    1.1研究對象 回顧性分析2017年1月至2021年8月在上海市第一人民醫(yī)院血液科初診并保留骨髓DNA樣本的髓系腫瘤患者943例,參照世界衛(wèi)生組織2016年髓系腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)對初診MDS患者、MDS/骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)患者和AML患者進(jìn)行診斷及分型[5]。共篩選出伴BCOR/BCORL1突變的AML、MDS和MDS/MPN患者47例,其中AML患者31例(66.0%),MDS患者14例(29.8%),MDS/MPN患者2例(4.2%),患者中男性24例(51.1%),女性23例(48.9%),年齡范圍44(33~58)歲。

    所有標(biāo)本均在本檢驗醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行血常規(guī)檢查、出血和凝血常規(guī)檢查、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞免疫表型分析、白血病融合基因分析和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。髓系腫瘤相關(guān)基因突變分析由上海睿昂基因科技公司完成。所有患者均知情同意,且經(jīng)上海市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:院倫審[2021]033號)。

    1.2主要儀器及試劑 CX33顯微鏡(日本Olympus公司),Navios流式分析儀及配套試劑(美國Beckman-Coulter公司),NanoDrop超微量紫外分光光度計(美國Thermo-Fisher公司),Ikaros核型分析系統(tǒng)(德國Metasystems公司)。Wright-Giemsa染液(珠海貝索生物技術(shù)公司),RNA抽提試劑盒、DNA抽提試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技公司),骨髓染色體培養(yǎng)基(上海樂辰生物科技公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),56種融合基因篩查試劑盒(上海睿昂基因科技公司)。

    1.3方法

    1.3.1骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 以髂后或髂前上棘作為穿刺點,抽取骨髓液0.2 mL制成骨髓涂片,經(jīng)過瑞-吉氏染色,在光學(xué)低倍鏡下觀察骨髓增生程度并計數(shù)全片巨核細(xì)胞,在分布均勻處通過油鏡計數(shù)200個有核細(xì)胞,并觀察細(xì)胞形態(tài)。所有骨髓片均由2名有經(jīng)驗的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)工作者復(fù)審,得出結(jié)果。

    1.3.2骨髓細(xì)胞免疫分型 使用Navios多色流式細(xì)胞儀檢測,用八色熒光抗體標(biāo)記(FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PECY7、APC、APC-H7、V450、PB、BV421、V500)標(biāo)本。用于分析的抗體包括:CD34、CD117、HLA-DR、CD38、CD123、CD33、CD13、CD15、CD64、CD36、CD11b、CD14、CD19、cCD79b、CD10、CD20、CD5、CD2、CD7、cCD3、CD4、CD8、CD3、CD56、CD16、MPO 等。

    1.3.3融合基因檢測 抽取各患者EDTA-K2抗凝骨髓2~4 mL,采用柱式抽提盒提取mRNA。采用多重巢式PCR篩查急性白血病相關(guān)56種融合基因,包括RUNX1-RUNX1T1、BCR-ABL1、CBFβ-MYH11、KMT2A-MLLT6、KMT2A-MLLT11、KMT2A-MLLT3,KMT2A-MLLT10等。以Ct值<33判為陽性。

    1.3.4二代測序(next-generation sequencing, NGS) 抽取各患者EDTA-K2抗凝骨髓2~4 mL,采用磁珠法提取DNA。取1 μg DNA制備DNA全基因組文庫。使用PCR引物擴(kuò)增目的基因組,將目標(biāo)區(qū)域DNA富集后,采用illumina測序平臺進(jìn)行測序。測序后原始數(shù)據(jù)利用人基因組數(shù)據(jù)庫(hg19/GRCh37)、dbSNP、1000 genomes、HGMD、SIFT 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析,確定致病基因的突變位點。平均靶基因覆蓋率(on target coverage)≥90%,平均測序深度≥1 000×。用于髓系腫瘤相關(guān)基因突變的高通量測序(next generation sequence,NGS)檢測,包括NPM1、FLT3、KIT、CEBPA、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、EZH2、RUNX1、ASXL1、PHF6、TP53、SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、NRAS、CBL、SETBP1、ETV6、JAK1/2等42種基因熱點突變區(qū)域。

    1.3.5染色體核型分析 收集患者肝素抗凝骨髓細(xì)胞2~4 mL,采用短期培養(yǎng)法(RPMI 1640培養(yǎng)液,含20%小牛血清),依照文獻(xiàn)進(jìn)行染色體制備及顯帶處理[6]。染色體核型描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN, 2016)》[7]。

    1.3.6隨訪及療效評價 隨訪資料來源于住院病歷、門診病例以及電話隨訪。隨訪截止時間為 2021年 8月 31日。完全緩解(complete remission,CR)、部分緩解(partial remission,PR)、未緩解(non-remission,NR)的判定標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行??偵?overall survival,OS)時間,定義為首次確診至死亡或隨訪截止的時間。無病生存(disease-free survival,DFS)時間定義為首次完全緩解至疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展、死亡或隨訪截止的時間。

    1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用GRAPHPAD 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。BCOR/BCORL1突變組與野生型組中不符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25,P75)]表示,組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗,兩組間率的比較采用卡方(χ2)檢驗,BCOR/BCORL1突變位置、治療方法對髓系腫瘤患者生存(DFS、OS)的影響應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析(Log-Rankχ2值)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1BCOR/BCORL1患者的突變類型 47例患者中,BCOR突變患者33例(占70.2%),BCORL1突變患者14例(占29.8%)。BCOR/BCORL1突變在AML和非AML(MDS和MDS/MPN)患者中的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.825,P=0.066),見表1。依據(jù)突變類型,點突變在AML患者中出現(xiàn)頻率較高,占51.1%(24/47),MDS和MDS/MPN患者中以移碼突變、缺失突變和剪切體突變等其他類型突變?yōu)橹?,?9.1%(9/47),分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.458,P=0.006)。

    表1 BCOR/BCORL1突變患者的臨床病理參數(shù)

    2.2BCOR/BCORL1突變患者共突變基因表達(dá)譜及功能分類 通過高通量測序檢出共突變基因28個。除BCOR/BCORL1外,6.4%(3/47)的患者不伴有其他基因突變;38.3%(18/47)的患者至少伴有1個基因突變;55.3%(26/47)的患者伴2個及以上基因突變。

    依照突變基因功能分類,共突變基因涉及多個通路,發(fā)生頻率較高的依次為DNMT3A(19.1%,9/47)、IDH2(17.0%,8/47)、IDH1(12.8%,6/47)、WT1(12.8%,6/47)、RUNX1(10.6%,5/47)、TP53(10.6%,5/47)和NRAS(10.6%,5/47)。伴BCOR/BCORL1突變髓系腫瘤患者突變共存關(guān)系見圖1。共突變頻率最高的通路依次是轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因突變(31.9%,15/47)、代謝酶相關(guān)基因突變(29.8%,14/47)、信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因突變(27.7%,13/47)、甲基化相關(guān)基因突變(25.5%,12/47)、染色質(zhì)與黏附分子相關(guān)基因突變(23.4%,11/47)和剪切子相關(guān)基因突變(10.6%,5/47),突變分類、相關(guān)突變基因及突變率見表2。

    圖1 47例BCOR/BCORL1髓系腫瘤突變患者共突變基因表達(dá)譜

    表2 共突變基因譜中涉及的突變基因及突變率

    2.3BCOR/BCORL1突變患者病理參數(shù)分析BCOR突變組與BCORL1突變組在性別和年齡等臨床病理參數(shù)上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但BCOR突變組患者WBC計數(shù)顯著低于BCORL1突變組患者 (Z=2.730,P=0.006)。其他納入分析的臨床病理參數(shù)在兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。通過共突變基因譜分析發(fā)現(xiàn),代謝酶組突變患者WBC計數(shù)(Z=-3.500,P=0.018)、PLT計數(shù)(Z=82.500,P=0.027)、Fib含量(Z=-0.935,P=0.008)顯著低于野生型患者,TT明顯延長(Z=0.800,P=0.027),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;甲基化組突變患者Fib含量顯著低于野生型患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.855,P=0.030);信號通路相關(guān)基因突變患者WBC計數(shù)顯著高于野生型患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=5.500,P=0.019);轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因突變患者PT短于野生型患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.600,P=0.008)。見圖2。

    注:*,P<0.05;**,P<0.01。

    2.4BCOR/BCORL1突變患者生存及預(yù)后分析 伴有BCOR/BCORL1突變患者中位隨訪時間為419(237,778)d,中位DFS時間為180(61,412)d。其中,伴BCOR突變患者的中位隨訪時間和中位無白血病生存期(LFS)時間為170(61,412)d,伴BCORL1突變患者中位隨訪時間和中位LFS時間為196.5(74,385)d,二者OS和DFS之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.390,P=0.532;χ2=0.626,P=0.429)。結(jié)構(gòu)域突變患者中位DFS時間明顯短于非結(jié)構(gòu)域突變患者(χ2=4.920,P=0.027),但對患者的OS沒有影響(χ2=2.787,P=0.095,圖3)。突變的種類(是否為點突變)、伴有的共突變數(shù)量等對DFS和OS均無影響。

    61.7%(29/47)的突變患者進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),移植組患者中位DFS時間(χ2=7.703,P=0.006)和中位OS時間(χ2=13.380,P=0.000)均明顯高于未移植組患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

    注:A,結(jié)構(gòu)域突變組與非結(jié)構(gòu)域突變組DFS和OS曲線;B,移植組與未移植組患者DFS和OS曲線。

    3 討論

    基因組DNA突變與髓系腫瘤的演化、治療和預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。超過30%的MDS和MDS/MPN會進(jìn)展為AML,同時MDS和MDS/MPN中的一些突變相互重疊并且在進(jìn)展為AML后逐漸成為優(yōu)勢克隆,提示髓系腫瘤可能擁有共同基因表達(dá)譜[10]。

    BCOR/BCORL1被證實是髓系腫瘤中反復(fù)發(fā)生的分子遺傳事件[11]。BCOR和BCORL1突變頻率在各研究組間存在差異,目前文獻(xiàn)報道BCOR在髓系腫瘤中的發(fā)生率為4%~12%,BCORL1的突變率為0.8%~13%[12-13],分析原因后筆者推測和疾病種類、人種及地域有關(guān)。本中心發(fā)現(xiàn)的BCOR突變率約為3.5%(33/943),BCORL1突變率約為1.5%(14/943),與上述國內(nèi)文獻(xiàn)報道基本一致。

    進(jìn)一步分析BCOR/BCORL1突變患者病理參數(shù)發(fā)現(xiàn),BCOR和BCORL1突變患者年齡、性別、PLT、紅細(xì)胞、APTT、TT和Fib等差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但BCOR突變患者WBC計數(shù)顯著低于BCORL1患者,且BCOR突變的AML患者WBC中位數(shù)顯著低于參考區(qū)間。岑燕霞等[13]發(fā)現(xiàn),MDS中BCOR突變型患者的WBC顯著低于野生型,提示伴BCOR突變具有原始細(xì)胞過度增殖但WBC增生減低的特性。另有學(xué)者證實,BCOR突變和丟失可導(dǎo)致BCORmRNA表達(dá)量下降,引起髓系祖細(xì)胞無序增殖,抑制分化,進(jìn)而導(dǎo)致伴BCOR突變的AML患者外周血WBC增生低下[1,3,11]。這與本研究觀察到的結(jié)果一致,推測此類患者可能更易發(fā)生嚴(yán)重感染。

    髓系腫瘤往往伴隨多種突變發(fā)生,本研究中最常見的共突變基因是轉(zhuǎn)錄因子突變和甲基化突變,與國內(nèi)外髓系腫瘤基因譜結(jié)果基本一致[4,13]。其中代謝酶組突變患者WBC和PLT計數(shù)顯著低于野生型患者,同時TT顯著高于野生型患者,代謝酶突變組和甲基化突變組Fib含量明顯低于野生型患者,說明伴有這些共突變患者出血傾向可能更為明顯。Fib與髓系腫瘤突變是否具有相關(guān)性,目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)支持,但在腦膠質(zhì)瘤研究中已發(fā)現(xiàn)代謝酶基因突變(IDH1/2)與Fib含量減低有相關(guān)性,提示該突變可能與凝血相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控有關(guān),有學(xué)者推測在髓系腫瘤中代謝酶也具有類似作用,但需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究[14]。

    既往研究證實,伴BCOR/BCORL1突變的髓系腫瘤預(yù)后不良,但突變位置是否影響預(yù)后國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。本研究顯示,雖然結(jié)構(gòu)域突變比非結(jié)構(gòu)域突變的患者DFS時間更短,但對OS無影響,提示突變發(fā)生在結(jié)構(gòu)域?qū)COR/BCORL1功能影響更為顯著。Abuhadra等[2]在對MDS患者的BCOR/BCORL1結(jié)構(gòu)域的研究中發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)域突變患者OS明顯低于非結(jié)構(gòu)域突變患者,預(yù)后不良,不一致原因考慮與樣本數(shù)量及病種有關(guān)。本研究中無論患者移植前是否緩解,相比常規(guī)化療,異基因造血干細(xì)胞移植可有效延長突變患者的DFS和OS,因此,伴BCOR/BCORL1突變的患者在條件允許情況下,應(yīng)盡早進(jìn)行移植以改善生存。

    綜上所述,伴BCOR/BCORL1突變的髓系患者具有更低的外周血WBC計數(shù),共表達(dá)代謝酶和甲基化突變的患者血漿Fib含量更低,具有更為明顯的出血傾向。異基因造血干細(xì)胞移植能有效延長BCOR/BCORL1突變患者生存期,因此,具有該類突變患者應(yīng)盡早進(jìn)行移植。對髓系腫瘤患者進(jìn)行NGS檢測,有助于此類患者預(yù)后分層評估和治療選擇??紤]到本研究收集的病例數(shù)較少,筆者未將BCOR和BCORL1分開進(jìn)行共表達(dá)譜的分析,兩者之間的共表達(dá)譜突變是否存在差異,尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步討論。

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