不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草的防效及安全性分析

賈小霞 馬 勝 齊恩芳 呂和平 劉 石 黃 偉 李 掌 曲亞英

(1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所/甘肅省馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070;2國(guó)家種質(zhì)資源渭源觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 渭源 748201)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)營(yíng)養(yǎng)豐富，用途廣泛，不僅關(guān)系糧食安全，而且是解決貧困的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。近年來(lái)，隨著國(guó)家馬鈴薯“主糧化”戰(zhàn)略的推進(jìn)，其在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的地位更加突出，種植面積不斷擴(kuò)大。然而，隨著馬鈴薯大面積規(guī)?；N植，雜草防治成為馬鈴薯生產(chǎn)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題[2]。由于人工除草勞動(dòng)強(qiáng)度大、成本高，施用除草劑已成為各國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)的一項(xiàng)重要除草措施[3-4]。目前，常用的馬鈴薯專用除草劑有二甲戊靈、乙草胺、精異丙甲草胺等苗前土壤處理劑和嗪草酮、砜嘧磺隆、精喹禾靈等莖葉處理劑[5]。但土壤處理劑受環(huán)境因素影響較大，而且不能見草施藥，在用藥上存在很大的局限性和盲目性，藥效較難保證[6]；莖葉處理劑均為選擇性除草劑，每種除草劑只對(duì)少數(shù)雜草有效，沒有兼除多種雜草的作用，除草效率低、成本高[7]。廣譜滅生性除草劑殺草譜廣，除草效率高，但容易對(duì)作物產(chǎn)生藥害，往往導(dǎo)致植株變態(tài)，甚至死亡、絕產(chǎn)絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。因此，培育抗廣譜滅生性除草劑的馬鈴薯新品種一直是各國(guó)育種工作者的努力方向之一[9]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了有效途徑。

生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的廣譜滅生性除草劑——草銨膦，作用靶標(biāo)是植物氮代謝中的關(guān)鍵酶——谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)[10]。Bar基因來(lái)源于土壤吸水鏈霉菌，其編碼的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyhransferase，PAT)蛋白可使草銨膦的自由氨基乙?；?duì)GS活性的抑制作用，表現(xiàn)出草銨膦抗性[11]，該基因已成功轉(zhuǎn)入水稻[12]、油菜[13]、小麥[14]等多種作物，且自1999年美國(guó)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)Bar基因水稻LLRICE06和LLRICE62商業(yè)化種植以來(lái)，已有多個(gè)轉(zhuǎn)Bar基因水稻品種被美國(guó)、加拿大、俄羅斯等多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)食用和飼用，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[15]。然而人們擔(dān)心草銨膦的作用靶標(biāo)單一，在抗性作物連作時(shí)容易誘導(dǎo)雜草產(chǎn)生抗藥性，可能產(chǎn)生超級(jí)雜草。常規(guī)除草劑在抗草銨膦等轉(zhuǎn)基因馬鈴薯田的合理使用可以有效延緩和治理抗性雜草的產(chǎn)生，因此，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗除草劑馬鈴薯對(duì)非靶標(biāo)除草劑的敏感性及其安全性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

在馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究中，已有多項(xiàng)研究以Bar基因作為篩選標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化材料[16-17]，但關(guān)于所選材料的除草劑抗性研究鮮見報(bào)道。前期，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有Bar基因和抗逆轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入多個(gè)隴薯系列馬鈴薯品種中[18]，經(jīng)抗性篩選獲得了具有穩(wěn)定草銨膦抗性的馬鈴薯材料[19-20]。隨著我國(guó)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)基因監(jiān)管政策的調(diào)整，轉(zhuǎn)基因耐廣譜滅生性除草劑作物的推廣種植可能將是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的必然選擇和確保我國(guó)糧食安全的戰(zhàn)略需求[21-22]。為了明確轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯環(huán)境釋放的安全性，有必要對(duì)抗性材料進(jìn)行靶標(biāo)、非靶標(biāo)除草劑及環(huán)境安全性評(píng)價(jià)。因此，本研究以轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯為研究材料，在田間對(duì)靶標(biāo)除草劑草銨膦和非靶標(biāo)除草劑草甘膦、滅草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈的雜草防效及安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為轉(zhuǎn)Bar基因抗草銨膦馬鈴薯的商業(yè)化種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯材料由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究室提供。供試41%草甘膦異丙胺鹽水劑，由美國(guó)孟山都公司生產(chǎn)；供試480 g·L-1滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈可分散油懸浮劑，由山東中禾化學(xué)有限公司生產(chǎn)；供試10%草銨膦水劑和HD400背負(fù)式電動(dòng)噴霧器(藥劑噴施器具)，由河北威遠(yuǎn)生化農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地隔離區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，即于馬鈴薯出苗后20 d時(shí)，分別將推薦劑量為中劑量的草甘膦，推薦劑量為高劑量的滅草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈可分散油懸浮劑和草銨膦加入450 kg·hm-2的自來(lái)水中(表1)，混勻后按小區(qū)定向莖葉噴施田間雜草。每個(gè)處理3次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積16 m2，行距60 cm，株距33 cm，小區(qū)間設(shè)1 m的隔離帶。

表1 除草劑組分及有效成分含量

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 除草劑對(duì)馬鈴薯藥害和對(duì)雜草的防效調(diào)查 分別于藥后7和14 d，肉眼觀察馬鈴薯表型，觀察除草劑是否對(duì)馬鈴薯造成藥害，如有藥害發(fā)生，藥害癥狀和藥害級(jí)別參照余桂容等[23]的方法進(jìn)行描述。分別于藥后30和45 d，調(diào)查除草劑對(duì)雜草的防效，調(diào)查方法和防效計(jì)算均參照賈小霞等[19]的方法。

1.3.2 馬鈴薯生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 噴施除草劑后30和45 d時(shí)，每小區(qū)按對(duì)角線選擇6株馬鈴薯，測(cè)量株高、莖粗和根莖葉鮮干重。采用卷尺測(cè)量株高，即植株地上莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的高度(cm)；采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺緊貼土壤層從植株的正面和側(cè)面兩個(gè)方向測(cè)量莖直徑，用平均值表示植株的莖粗(mm)[24]；用電子稱測(cè)定根莖葉鮮干重(g)，即采挖整株馬鈴薯，測(cè)完鮮重(g)后，于105℃殺青30 min，80℃烘至恒重后，測(cè)定干重(g)。

1.3.3 成熟期馬鈴薯產(chǎn)量、品質(zhì)和除草劑殘留測(cè)定 成熟期(10月8日)，每小區(qū)按對(duì)角線收獲6株馬鈴薯，同時(shí)收集根際土壤測(cè)定除草劑殘留。收獲的塊莖混合測(cè)定產(chǎn)量后求平均值計(jì)算株平均產(chǎn)量(g)，然后用清水沖洗表面泥土等雜質(zhì)，一部分用于淀粉、干物質(zhì)、粗蛋白、還原糖和維生素C等品質(zhì)性狀含量的測(cè)定，一部分用于除草劑殘留的測(cè)定。

品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)都參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，其中淀粉含量參照NY/T 11-1985[25]采用旋光法測(cè)定；干物質(zhì)含量參照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法測(cè)定；粗蛋白含量參照GB 5009.5-2016[27]采用凱氏定氮法測(cè)定；還原糖含量參照 GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法測(cè)定；維生素C含量參照 GB/5009.86-2016[29]采用熒光法測(cè)定。馬鈴薯塊莖和土壤中的草銨膦殘留參照GB 23200.108-2018[30]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)法檢測(cè)，滅草松、砜嘧磺隆和精喹禾靈均參照BS EN 15662∶2018[31]采用LC-MS法檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office Excel 2010整理分析；采用DPSV 3.01軟件進(jìn)行單因素方差(one-way analysis，ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析；差異顯著性采用Duncan’s 法分析。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同除草劑處理下馬鈴薯藥害分析

由表2可知，施藥后7和14 d時(shí)，T1、T2、T3和T4處理區(qū)馬鈴薯生長(zhǎng)正常，與清水對(duì)照(CK)一致，無(wú)藥害癥狀出現(xiàn)；而T5處理區(qū)馬鈴薯受害嚴(yán)重，施藥后7 d時(shí)莖葉萎蔫黃化，14 d時(shí)植株全部干枯死亡。由于施藥后14 d時(shí)T5處理區(qū)馬鈴薯全部死亡，因此，后續(xù)試驗(yàn)不對(duì)其進(jìn)行分析。

表2 噴施不同除草劑7和14 d時(shí)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯藥害統(tǒng)計(jì)

2.2 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯生長(zhǎng)的影響

施藥后30和45 d時(shí)，各藥劑處理區(qū)和對(duì)照區(qū)馬鈴薯一樣，都能正常生長(zhǎng)，表型上沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，說(shuō)明試驗(yàn)劑量的藥劑對(duì)馬鈴薯沒有產(chǎn)生明顯藥害。由表3可知，藥后30 d，不同處理區(qū)的馬鈴薯各生長(zhǎng)指標(biāo)差異較大，各處理的平均株高為56.18～63.74 cm，其中T4與T3處理的平均株高無(wú)顯著差異，但T4處理的平均株高顯著高于T2、T1和CK；平均莖直徑為9.23～10.03 mm，其中T4、T3和T2處理間無(wú)顯著差異，但顯著高于CK和T1，且CK與T1無(wú)顯著差異；根莖葉平均株鮮重為187.61～240.17 g，其中T4顯著高于T3和其他處理，T3顯著高于T2、T1和CK，T2、T1和CK間無(wú)顯著差異；根莖葉平均株干重為19.24～28.04 g，其中T4顯著高于其他處理，T3顯著高于T2、T1和CK，T2顯著高于CK，T1與CK間無(wú)顯著差異。

表3 施藥后30 d時(shí)不同除草劑對(duì)抗草銨膦馬鈴薯生長(zhǎng)的影響

由表4可知，藥后45 d，各處理的平均株高為60.69～66.21 cm，其中T4與T3之間無(wú)顯著差異，但顯著高于T1和CK；平均莖直徑為9.37～11.01 mm，其中T4、T3和T2處理間無(wú)顯著差異，但顯著高于T1和CK，T1與CK間無(wú)顯著差異；根莖葉平均株鮮重為200.57～267.37 g，其中T4>T3>T2，且各處理間差異顯著，T1與CK間無(wú)顯著差異，但顯著低于其他處理；根莖葉平均株干重為21.57～32.34 g，各處理間的差異水平同平均株鮮重。成熟期單株產(chǎn)量從高到低依次為T4>T3>T2>T1>CK，且各處理間的差異均達(dá)到顯著水平。

表4 施藥后45 d時(shí)不同除草劑對(duì)抗草銨膦馬鈴薯生長(zhǎng)和成熟期單株產(chǎn)量的影響

2.3 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯塊莖營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表5可知，成熟期各處理馬鈴薯塊莖的平均淀粉含量為15.80%～16.07%，平均粗蛋白含量為2.39%～2.56%，平均還原糖含量為0.46%～0.49%，平均維生素C含量為14.67～15.48 mg·100g-1，平均干物質(zhì)含量為18.44%～19.15%，各指標(biāo)在所有處理間有差異，但均未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明試驗(yàn)劑量的除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯的塊莖營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)無(wú)顯著影響。

表5 不同除草劑對(duì)馬鈴薯塊莖營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

2.4 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草的防治效果

試驗(yàn)田雜草主要有闊葉雜草薺菜(Capsellabursa-pastorisL.Medic.)、苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、反枝莧(AmaranthusretroflexusL.)、馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)和田旋花(ConvolvulusarvensisL.)，禾本科雜草野燕麥(AvenafatuaL.)、狗尾草(SetairaviridisL.Beauv.)、旱稗[Echinochloahispidula(Retz)Nees.]和牛筋草(EleusineindicaL.Gaertn.)。由于雜草種類較多，雜草防效按照闊葉雜草和禾本科雜草兩大類進(jìn)行計(jì)算。

如表6所示，藥后30 d，T1、T2、T3和T4對(duì)闊葉雜草的株防效分別為10.46%、32.22%、58.56%和 86.22%，對(duì)禾本科雜草的株防效分別為6.38%、72.06%、84.43%和94.06%；藥后45 d，T1、T2、T3和T4對(duì)闊葉雜草的株防效分別為19.26%、30.51%、54.39%和82.51%，鮮重防效分別為25.85%、48.27%、64.56%和86.72%；對(duì)禾本科雜草的株防效分別為3.87%、70.38%、82.23%和92.38%，鮮重防效分別為4.09%、76.78%、85.01%和92.78%?？梢钥闯?，除T1處理對(duì)禾本科雜草的株防效和鮮重防效都低于7%外，其他處理對(duì)闊葉雜草和禾本科雜草均有明顯的防治效果，且兩類雜草的株防效和鮮重防效從高到低的順序一致，都表現(xiàn)為T4>T3>T2>T1，且各處理間的差異均達(dá)到極顯著水平。

表6 不同除草劑對(duì)轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防治效果

2.5 馬鈴薯塊莖和土壤中除草劑殘留分析

由表7可知，成熟期各處理區(qū)馬鈴薯塊莖和土壤中滅草松、精喹禾靈、砜嘧磺隆和草銨膦的檢測(cè)值均小于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為未檢出，表明試驗(yàn)劑量的各藥劑均不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害。

表7 農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果

3 討論

綜合考慮除草劑對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)安全性及對(duì)雜草的防除效果，非靶標(biāo)除草劑草甘膦(T5)在殺滅雜草的同時(shí)，對(duì)馬鈴薯產(chǎn)生了嚴(yán)重藥害，致使馬鈴薯植株干枯死亡、絕產(chǎn)絕收，受害率達(dá)100%。草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型、非選擇滅生性除草劑[32-33]，雖然具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但它對(duì)馬鈴薯同樣具有滅殺作用，不能應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田。通過(guò)比較各藥劑處理下馬鈴薯的株高、莖粗、植株鮮/干重、單株產(chǎn)量和品質(zhì)等特性與噴施清水對(duì)照(CK)間的差異，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)劑量的非靶標(biāo)除草劑滅草松(T1)、11%砜嘧磺隆·精喹禾靈(T2)以及二者的復(fù)配劑(T3)對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)過(guò)程安全無(wú)藥害，但各處理對(duì)雜草的防效和對(duì)馬鈴薯的增產(chǎn)效果差異較大。當(dāng)以滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草時(shí)，滅草松對(duì)雜草的防治效果較差，藥后30 d，推薦劑量的高劑量(T1)對(duì)闊葉和禾本科雜草的株防效分別僅為10.46%和6.38%，雖然馬鈴薯的前期長(zhǎng)勢(shì)與噴施清水對(duì)照(CK)無(wú)顯著差異，但還是大大減少了對(duì)馬鈴薯養(yǎng)分吸收的影響，成熟期馬鈴薯單株產(chǎn)量較對(duì)照增加了16.87%，這與劉巍等[34]采用有效成分1 440 g·hm-2的滅草松處理普通馬鈴薯田間雜草時(shí)，藥后30 d闊葉雜草的株防效為98.17%的研究結(jié)果差異較大，這種差異可能是由于不同地區(qū)的雜草種類和氣候條件差異以及除草劑的使用時(shí)間不同所致，仍需進(jìn)一步研究。本研究中，藥后45 d，11%砜嘧磺隆·精喹禾靈的高劑量(T2)對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效分別為30.51%和48.27%，對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效分別為70.38%和76.78%，馬鈴薯單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加42.12%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加21.61%。11%砜嘧磺隆·精喹禾靈和滅草松的復(fù)配劑對(duì)雜草的防效顯著高于二者單獨(dú)使用時(shí)的防效，藥后45 d，推薦劑量高劑量的復(fù)配劑(T3)對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效較滅草松單獨(dú)處理(T1)分別提高35.13和38.71個(gè)百分點(diǎn)，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)分別提高23.88和16.29個(gè)百分點(diǎn)；對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效較滅草松單獨(dú)處理(T1)分別提高78.36和80.92個(gè)百分點(diǎn)，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)分別提高11.85和8.23個(gè)百分點(diǎn)；馬鈴薯單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加58.39%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加35.52%，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)增加11.44%。綜上可知，雖然滅草松、砜嘧磺隆和精喹禾靈已在馬鈴薯田獲得登記應(yīng)用，但單獨(dú)處理的雜草防效均不及復(fù)配劑，這與吳仁海等[35]的研究結(jié)論一致。

通過(guò)比較草銨膦處理下馬鈴薯的株高、莖粗、植株鮮/干重、單株產(chǎn)量和品質(zhì)等特性與噴施清水對(duì)照(CK)間的差異，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)除草劑草銨膦的高劑量對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)過(guò)程安全無(wú)藥害，這與賈小霞等[19]的研究結(jié)果一致；對(duì)闊葉雜草的株、鮮重防效都高于82.51%，對(duì)禾本科雜草的株、鮮重防效都高于92.38%，均顯著高于T1、T2和T3；單株產(chǎn)量較噴施清水對(duì)照(CK)增加67.40%，較滅草松單獨(dú)處理(T1)增加43.24%，較11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理(T2)增加17.79%，較滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈復(fù)配劑處理(T3)增加5.6%。相比滅草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾靈單獨(dú)處理，用二者的復(fù)配劑與草銨膦輪換防治轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草，可以達(dá)到較理想的防治效果。

從藥劑在馬鈴薯塊莖及土壤中的殘留分析結(jié)果看，各處理馬鈴薯和土壤中滅草松、精喹禾靈和砜嘧磺隆的檢測(cè)值均小于0.01，草銨膦在馬鈴薯和土壤中的檢測(cè)值均小于0.10，都小于檢測(cè)限，可以認(rèn)為不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留危害，說(shuō)明所有處理對(duì)薯塊和環(huán)境都是安全的。

本研究?jī)H選擇了靶標(biāo)除草劑草銨膦和3種非靶標(biāo)除草劑，只對(duì)推薦劑量的高劑量對(duì)轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草的防效及食用和環(huán)境安全性進(jìn)行了分析，而關(guān)于這些除草劑更高劑量和其他新型除草劑的使用安全性還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用草銨膦推薦劑量的高劑量可以高效防治轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯田間雜草，減少雜草對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響，顯著提高生產(chǎn)效率。但為了防止轉(zhuǎn)Bar基因馬鈴薯連作時(shí)，因靶標(biāo)除草劑草銨膦作用單一而誘導(dǎo)雜草產(chǎn)生草銨膦抗性的風(fēng)險(xiǎn)，建議用有效成分1 440 g·hm-2的滅草松和99 g·hm-211% 砜嘧磺隆·精喹禾靈復(fù)配劑與草銨膦輪換防治雜草。