超聲處理對牦牛乳酶促凝膠流變特性的影響研究

馬 燕 梁 琪,* 宋雪梅

(1 甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

乳蛋白形成凝膠是生產乳酪、酸乳等乳制品中最關鍵的一步，直接影響到產品的質量，常見的形成方式是酶促凝膠。酶促凝膠時，凝乳酶首先專一切割乳液中κ-酪蛋白Phe105-Met106之間的肽鍵，釋放帶負電荷并提供空間作用的糖巨肽于乳清中[1]。其次，糖巨肽被解離導致酪蛋白膠束之間的斥力降低，解離達到85%～90%時，酪蛋白通過疏水作用和鈣離子的橋聯(lián)作用結合在一起，形成一種孔徑為微米級大小的網絡結構[2]。最后，粒子間相互擠壓、凝膠進行脫水收縮，導致乳清從凝膠網絡結構中析出。凝膠的流變特性對乳制品的功能品質具有重要影響，脂肪與蛋白質的相互作用會影響凝膠的流變特性，其相互作用主要受脂肪球的形狀、大小和粒度分布等因素影響[3]。Luo等[4]研究發(fā)現蛋白質在脂肪球周圍形成凝膠的能力與其結構特征如疏水相互作用、電荷分布和三維結構等密切相關。

超聲處理(ultrasonic treatment，US)會對液體分子進行拉伸和壓縮，產生大量空穴并瞬間破裂，形成瞬時高溫和高壓等極端環(huán)境，使得乳液中脂肪球尺寸變小，脂肪球膜破裂[5]。而針對超聲后全脂乳凝膠特性的研究極少，學者主要以脫脂乳為原料，專注于超聲處理后蛋白質對乳凝膠特性的影響。研究發(fā)現，超聲會改變脫脂乳中酪蛋白膠束的空間結構，引起蛋白質疏水性變化，使得凝膠網絡改善[6-7]。

牦牛乳脂肪含量高(5.3%～8.8%)，脂肪球較大(平均直徑為4.39 μm)，乳液體系不穩(wěn)定[8]，且酪蛋白膠束的粒徑大，凝膠形成速率慢[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現牦牛乳中低濃度的κ-酪蛋白會影響酪蛋白膠束的酶水解速率，使得牦牛乳凝膠時間大于荷斯坦牛乳。牦牛乳的凝膠特性亟待改善。但目前超聲技術牦牛乳制品加工中鮮有相關報道，且尚未對超聲牦牛乳的酶促凝膠進行研究?；诖?，本研究通過改變超聲功率和處理時間，將不同超聲能量密度應用于牦牛乳，探究超聲牦牛乳的酶促凝膠流變特性，從乳蛋白疏水性和脂肪球粒徑的角度分析凝膠網絡形成，以期利用超聲技術改善牦牛乳酶促凝膠流變特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年7月上旬在甘肅省甘南藏族自治州合作市多河鄉(xiāng)獲取檢驗合格的牦牛乳，將其存于恒溫容器(4±2℃)中運輸帶回實驗室，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵劑(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種)，丹尼斯克中國有限公司；凝乳酶(小牛皺胃酶、牛胃蛋白酶，活力890 IMCU·g-1)，北京多愛特生物科技有限公司；其余藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物股份科技有限公司；奧林巴斯BX53熒光顯微鏡，上海普赫光電科技有限公司；Bettersize2600激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司；T6紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TD5RZ乳脂離心機，湘儀離心機儀器有限公司；LVDV-1型數字旋轉粘度計，上海方瑞儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；MCR301流變儀，奧地利Anton Paar公司；F380熒光分光光度計，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛乳的超聲條件 超聲發(fā)生器頻率20 kHz，將直徑6 mm的尖端伸入250 mL燒杯中進行超聲處理。每次處理乳樣200 mL，設定溫度為15℃，樣品浸入冰浴中，用溫度探針連續(xù)記錄樣品的核心溫度(20±5℃)，探頭伸入液面約3 cm，超聲工作3 s，間歇3 s。設計2個完全隨機因素(超聲時間5和10 min，超聲功率300、400和500 W)，以未處理的牦牛乳作為對照樣品(CK)，共7種處理條件，具體見表1。參照Balthazar等[11]的公式，計算應用到樣品上的能量密度(energy density，ED)：

表1 牦牛乳超聲處理條件

(1)

式中，P為超聲功率，w；t為超聲時間，min；V為處理樣品量，mL。

1.3.2 超聲牦牛乳脂肪、蛋白質及pH值測定 參考《GB 5009.6-2016食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[12]中的第四法測定脂肪含量，《GB/T 5009.5-2010食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[13]中的第一法測定蛋白質含量。取20 mL待測樣品，用pHS-3C精密pH計測定樣品pH值。

1.3.3 超聲牦牛乳均質效率測定 參照Abesinghe等[14]的方法，將25 mL牦牛乳在1 292 r·min-1轉速下于40℃離心30 min。用蓋勃法測定脂肪含量。按照以下公式計算均質效率(homogenizing efficiency，HE)：

(2)

式中，m為底部20 mL樣品的質量，g；M為整個樣品的脂肪含量，g。

1.3.4 超聲牦牛乳穩(wěn)定性測定 根據Patil等[15]所述的重力法測量，用蘇丹Ⅲ區(qū)分出乳脂。樣品裝入25 mL離心管在4℃存放24 h，測量相分離的程度，按以下公式評估乳液的穩(wěn)定性(cream stability，CI)。

(3)

式中，Hc為乳脂層的高度，mm；Ht為乳的總高度，mm。

1.3.5 超聲牦牛乳黏度測定 使用數字旋轉粘度計，選用3號轉子，轉速為30 r·min-1。將超聲牦牛乳在水浴中預熱至35℃，取出20 mL，調節(jié)pH值為5.6，加入氯化鈣及酶液，混勻30 s后，分別于0、10、20、30、40、50、60 min時記錄黏度值。

1.3.6 超聲牦牛乳酶促凝膠流變特性測定 參照Zhao等[16]的方法并稍作修改，將牦牛乳在35℃水浴保溫10 min，分別取不同處理下的乳樣4 mL，調節(jié)pH值為5.6，加入氯化鈣，停留1 min，加入酶液，混勻，立即轉移到流變儀平板上。測試條件如下：溫度35℃，平行板60 mm，間隙1 000 μm，頻率1 Hz，應力0.1 Pa，間隔10 s，時間60 min，測定均在線性粘彈性區(qū)域內。儲能模量表征彈性屬性，用G′表示；損耗模量表征粘性屬性，用 G″ 表示。

1.3.7 超聲牦牛乳濁度測定 參照Choi等[17]的方法并稍作修改，將處理后的樣品搖勻后準確移取200 μL，用去離子水稀釋至10 mL，室溫下用紫外分光光度計在860 nm處測定樣品溶液的吸光度，參比溶液為去離子水，平行測定3次，取平均值。

1.3.8 超聲牦牛乳熒光特性測定 參照Yazdi等[18]的方法并稍作修改，25℃下采用熒光分光光度計測定其熒光發(fā)射光譜，用微量移液器移取超聲牦牛乳100 μL，加入20 mL去離子水并混勻，熒光光譜激發(fā)波長為235 nm(狹縫5.0 nm)，發(fā)射光譜采集范圍為200～800 nm(狹縫5.0 nm)，掃描速率為1 200 nm·min-1。

1.3.9 超聲牦牛乳脂肪球的微觀結構及粒徑分布測定 參照Ménard等[19]的方法并稍作修改。將恢復至室溫的牦牛乳輕輕晃動，取10 μL于載玻片上，用配備油浸透鏡的光學顯微鏡(放大倍數100)觀察牦牛乳微觀結構并拍照。參照Luo等[8]的方法，使用激光粒度分布儀測量牦牛乳脂肪球的粒度分布。乳脂肪小球的折射率為1.458，水的折射率為1.333[20]。試驗在室溫下進行，將100 μL的樣品滴入設備的測量池中，向池中加入1 mL 50 mmol·L-1乙二胺四乙酸-氫氧化鈉的緩沖液(pH值7.0)，破壞酪蛋白膠束。

1.4 統(tǒng)計與分析

測定均重復3次。采用Duncan法進行差異顯著性分析，結果以平均值±標準差表示。采用Excel 2010記錄數據、SPSS 2019分析數據、Origin 2018繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 超聲牦牛乳樣品的基礎指標

樣品單位體積所受到的能量稱作能量密度。由表2可知，不同超聲功率和超聲時間進行組合后，牦牛乳的能量密度不同。能量密度與超聲功率和超聲時間的乘積成正比。超聲5 min的US1、US3、US5能量密度小于超聲10 min的US2、US4、US6能量密度。能量密度由小到大排序為CK0.05)。Cameron等[21]發(fā)現使用乳制品光譜分析儀測定牛乳脂肪含量結果偏高是由超聲處理后脂肪球的表面積變大，光散射增加引起的。本研究使用蓋勃法[12]測定牦牛乳中的脂肪含量，發(fā)現超聲處理并未使牦牛乳脂肪含量出現顯著性變化(P>0.05)。應用凱氏定氮法測定樣品的蛋白質，發(fā)現超聲處理前后牦牛乳的蛋白質含量也無顯著性差異(P>0.05)，Marchesini等[5]在研究超聲荷斯坦牛乳時也有相同結果。牦牛乳的pH值在超聲處理前后未表現出顯著性差異(P>0.05)，可能的原因是超聲處理并未影響牦牛乳中礦物質形態(tài)及其平衡，未促使膠束中礦物質大幅度解離。

表2 超聲牦牛乳樣品的基礎指標

2.2 酶促凝膠形成中超聲牦牛乳粘度的變化

凝膠結構形成是一個動態(tài)的過程，超聲牦牛乳黏度的變化可以客觀反映凝膠形成的進度。由圖1可知，同一超聲處理量密度的牦牛乳，隨著凝膠時間的增加，黏度呈先增加后下降的趨勢。相同凝膠時間下，US3的黏度均顯著大于其他超聲處理組(P<0.05)，US4的黏度僅次于US3，CK的黏度最低。凝膠30 min時，US1、US2、US3和US4的黏度達到最大值，凝膠40 min時，CK、US5和US6的黏度達到最大值，此時凝膠結構均已形成。酶凝膠形成后，乳清不斷析出，導致牦牛乳黏度開始下降，脂肪和蛋白質的改變會使黏度發(fā)生變化。Tran等[22]研究發(fā)現由于酪蛋白和乳清蛋白的含量不足，難以覆蓋新形成的脂肪小球的表面積，從而引起黏度改變。Mohan等[23]研究指出由于脂肪和酪蛋白之間的相互作用，導致黏度發(fā)生改變。

注：不同小寫字母表示相同時間不同超聲條件下，黏度具有差異顯著性(P<0.05)；不同大寫字母表示同一超聲條件不同時間下，黏度具有差異顯著性(P<0.05)。

2.3 酶促凝膠形成中超聲牦牛乳的流變特性

乳凝膠是典型的粘彈性聚合物，儲能模量反映所形成凝膠結構的強度。由圖2-A可知，超聲處理組的儲能模量高于CK，超聲處理使得牦牛乳酶促凝膠的彈性增加，凝膠強度變大。從各樣品酶促凝膠過程中儲能模量的變化趨勢可知，樣品的儲能模量與凝膠時間呈正相關關系。US5和US6的儲能模量增長最明顯，分別為6 824 和7 189 Pa；US4、US2、US3和US1的儲能模量增長依次為2 013、1 595、1 157 和564 Pa；CK的儲能模量增長最小，為256 Pa。酶促凝膠形成中，隨凝膠時間的延長，酪蛋白膠束構成的索狀結構不斷生成新鍵，變粗糙，導致儲能模量增加。當超聲時間相同時，樣品儲能模量隨著超聲功率的增加而增大。在相同超聲功率下，超聲10 min的儲能模量大于超聲5 min的儲能模量。測量過程中，US4前13 min和US5前5 min損耗模量高于彈性模量，此時酶促凝膠結構形成受阻。CK、US1、US2、US3和US6的儲能模量均大于損耗模量，故彈性響應是凝膠過程中的主要響應。圖2-B表示損耗模量與凝膠時間的關系曲線，其趨勢與儲能模量相似，酶促凝膠的粘性變化類似于彈性變化。

圖2 超聲牦牛乳酶促凝膠過程中的儲能模量G′和損耗模量 G″

損耗正切角Tanδ與酶促凝膠變形過程中化學鍵的松弛行為有關，其大小能表征牦牛乳凝膠網絡的重排程度。由圖3可知，Tanδ與凝膠時間呈負相關關系，隨著凝膠時間的增加而逐漸降低。超聲處理組的Tanδ高于CK，表明超聲處理使凝膠網絡大規(guī)模重排。US1、US2、US3和US4凝膠具有較低的析水現象，凝膠持水力提高。US5和US6的超聲功率大，造成凝膠脫水收縮嚴重。

圖3 超聲牦牛乳酶促凝膠過程中的損耗正切角Tanδ

由表3可知，與CK的凝膠時間(9.35 min)相比，US1、US2、US3和US4分別將凝膠時間縮短了1.78、3.72、5.75和4.74 min，其中US3和US4的凝膠時間縮短了一半以上(61.49%和50.70%)，US5和US6的凝膠時間延長了8.74和22.96 min，凝膠網絡不易形成。US1～US4凝膠時間縮短，是因為超聲處理使酪蛋白膠束表面積增加，與凝乳酶結合位點更多地暴露出來，反應效率提高。US5凝膠時間延長，是由于脂肪球絮凝出現均質團簇，影響乳清蛋白從膠束聚集體中解離。US6凝膠時間延長，是由于超聲過度，分子間的共價鍵變得脆弱，限制膠束的聚集。將不同超聲功率和超聲時間進行組合后，牦牛乳受到的能量密度不同，未發(fā)現凝膠時間與能量密度之間呈現規(guī)律性變化。但同一超聲時間下，牦牛乳的凝膠時間受超聲功率的影響明顯，300或400 W均能有效縮短凝膠時間，500 W(US5和US6)時，功率過大，凝膠時間延長。超聲處理后牦牛乳濁度顯著降低(P<0.05)，說明超聲處理使得牦牛乳酪蛋白膠束間的相互作用力改變。US1、US3和US4濁度較低且相互之間不存在差異顯著性(P>0.05)。對所有樣品儲能模量曲線進行擬合，其中t為凝膠時間，G′為儲能模量值，除US4擬合曲線的R2值為0.980 6外，其余曲線的R2值均大于0.990 0，說明曲線的擬合效果好。超聲處理組的最大儲能模量及最大損耗模量均顯著高于CK(P<0.05)。

表3 超聲牦牛乳酶促凝膠流變特性

2.4 超聲牦牛乳蛋白疏水性對酶促凝膠網絡形成的影響

疏水相互作用會影響蛋白質結構，與乳凝膠特性顯著相關[24]。由圖4可知，與未超聲處理的牦牛乳相比，能量密度在600～900 J·mL-1的超聲牦牛乳最大發(fā)射波長發(fā)生移動，表明此時的色氨酸內部疏水環(huán)境發(fā)生改變。600 J·mL-1的US3最大熒光強度顯著增加了51.22%(P<0.05)，最大發(fā)射波長從359 nm藍移至357 nm。這表明色氨酸內部的剛性環(huán)境減弱，芳香族氨基酸殘基暴露，色氨酸殘基埋藏在疏水環(huán)境中，分子內色氨酸猝滅作用減弱，導致酪蛋白分子結構被破壞。1 200 J·mL-1的US4內部蛋白質重聚集，導致最大熒光強度顯著降低了5.31%(P<0.05)。400 J·mL-1的US1和1 500 J·mL-1的US6最大熒光強度均顯著增加(P<0.05)，但最大發(fā)射波長無顯著性變化(P>0.05)。這表明蛋白質分子內部發(fā)生膨脹，疏水性基團發(fā)生水合作用，使得酪氨酸和色氨酸等基團具有一定的自由轉動度，但色氨酸依然保持在內部疏水環(huán)境中。

注：不同的字母表示在相同能量密度下，熒光數值之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 超聲牦牛乳脂肪球粒徑對酶促凝膠網絡形成的影響

光學顯微鏡圖5顯示，牦牛乳脂肪球以橢圓形球體存在于乳漿中，超聲處理后脂肪球尺寸減小，但形狀并未改變。CK中存在最大的脂肪球，粒徑分布范圍為0.427～33.320 μm，脂肪球集中分布在4.502 μm處。形成較大的脂肪球的原因是脂肪球從乳腺上皮細胞分泌后被包裹時，受到了脂肪球膜的限制[19]。超聲處理牦牛乳后，脂肪球的峰形向左移動。US1與CK的脂肪球集中分布在同一處。由于超聲能量密度過小，未能達到充分的均質化，使得US1中仍然存在較大的脂肪球。在US3中觀察到更均勻的脂肪球，最高體積分數(10.54%)高于其他超聲處理組，脂肪球粒徑分布范圍為0.300～4.002 μm，集中在1.974 μm處。US4的脂肪球粒徑分布范圍為0.131～4.502 μm，呈雙峰分布，歸因于小脂肪球聚集。US5中可明顯觀察到脂肪球聚集和絮凝，形成均質團簇，此時乳液處于不穩(wěn)定狀態(tài)。由于較小的脂肪球具有更大的脂肪酶固定表面積，其與脂肪酶締合可以誘導小球的橋接，從而出現絮凝[25]。牦牛乳脂肪球膜組成和結構對脂肪酶的更高親和力會導致更多的小球結合在一起，脂肪球聚集更明顯[26]。隨著超聲能量密度的增加，脂肪球體積平均直徑(D4,3)和脂肪球面積平均直徑(D3,2)均呈現下降趨勢，US2、US4和US6能量密度分別為900、1 200、1 500 J·mL-1，與CK相比，分別下降了84.12%、86.87%和88.66%。US6中脂肪球被打散，球形結構不明顯，D3,2顯著下降了87.29%(P<0.05)，原因可能是超聲能量密度過大。

注：圖中圈出部分代表脂肪球聚集。

注：不同小寫字母表示不同能量密度下，D4,3(或D3,2)具有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

牦牛乳營養(yǎng)價值高，是加工奶酪、酸乳等乳制品的優(yōu)質乳源，但其凝膠速率慢、時間長，會影響生產效率。近年來，超聲處理技術在乳制品中的應用日益增多，如均質化、滅菌、消泡、過濾和改變發(fā)酵速率等[27-28]。本研究發(fā)現超聲處理后牦牛乳的脂肪含量和蛋白質含量無顯著變化(P>0.05)，但均質效率和乳液穩(wěn)定性顯著提高(P<0.05)。由于均質效率的提高，填充在蛋白質網絡結構中的脂肪更容易流動。石永祺等[29]研究指出流動的脂肪會減弱酪蛋白膠束間的相互作用。本研究發(fā)現利用超聲處理技術可以改變牦牛乳蛋白表面疏水性，影響酪蛋白膠束體系的凝膠化。Shanmugam等[30]發(fā)現超聲處理破壞酪蛋白-乳清蛋白的聚集體，引起乳清蛋白變性，但酪蛋白膠束和礦物質的完整性并未受到顯著影響，還指出超聲處理主要是減小脂肪球大小。本研究也發(fā)現超聲處理牦牛乳后，脂肪球的峰形向左移動，粒徑減小，脂肪球轉變成較小的顆粒，小尺寸脂肪球表面被酪蛋白顆粒的疏水部分覆蓋，形成新的脂肪球膜。事實上，脂肪球尺寸減小增加了脂肪球膜的表面積，而脂肪球膜表面積的增加本身就是脂肪球-酪蛋白網絡的形成。脂肪與蛋白質的相互作用會對凝膠產生影響。Akdeniz等[31]研究發(fā)現超聲增強了顆粒的部分遷移性，改善了蛋白和新形成的脂肪球-蛋白復合物之間的聚集。Nguyen等[32]指出新脂肪球膜的成分不同于天然的脂肪球膜，后者包含膜片段和酪蛋白，從而形成覆蓋脂肪球的致密蛋白質層。本研究還發(fā)現，超聲牦牛乳的蛋白疏水性及脂肪球粒徑會對凝膠網絡形成產生影響，小脂肪球與周圍的乳蛋白基質交聯(lián)，縮短了凝膠時間，導致更高的凝膠強度。Chandrapala等[33]研究發(fā)現大功率的超聲會對凝膠產生不良影響，主要是因為乳清蛋白會從膠束聚集體中解離同時脂肪球絮凝形成均質團簇。本研究發(fā)現同一超聲時間下，隨著超聲功率的增加，樣品儲能模量增大，凝膠時間縮短，然而功率過大(500 W)會對凝膠產生不良影響，延長凝膠時間。Scudinoa等[28]指出牛乳的膠體系統(tǒng)中存在一個物理化學邊界，需要跨越該過程才能形成凝膠。有學者研究發(fā)現能量密度從990 J·mL-1增加至1 386 J·mL-1時，水牛乳脂肪球尺寸逐漸變小，其中1 188 J·mL-1的能量密度下脂肪球最均勻，乳液穩(wěn)定性最好，具有較好的凝膠強度[14]。故在實際生產時，需根據具體要求對超聲條件進行優(yōu)化。

4 結論

本研究發(fā)現適宜的超聲處理不僅不會改變牦牛乳的脂肪含量和蛋白質含量，與此同時，還提高了牦牛乳的均質效率和乳液穩(wěn)定性，最終有效縮短凝膠時間，增加凝膠強度。但功率過大(500 W)會對凝膠產生不良影響，延長凝膠時間。超聲處理改變乳蛋白表面疏水性的同時減小了脂肪球尺寸，從而影響脂肪和蛋白質的相互作用。酶促凝膠的最佳超聲處理參數為功率400 W，時間5 min，但該參數仍需進一步優(yōu)化。本研究證實了超聲處理在牦牛乳制品生產中具有應用價值。雖然已經發(fā)現超聲處理有助于改善牦牛乳酶促凝膠流變特性，但脂肪與蛋白質的相互作用對凝膠特性影響的內在分子機制還需要進一步探究。