L-麥角硫因生物合成與應(yīng)用研究進(jìn)展

木開代斯·買合木提，陳 建，焦春偉，謝意珍*

1廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣州 510663；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，廣州 510225

天然麥角硫因?yàn)樽笮齃-麥角硫因(L-ergothioneine，L-EGT)，分子量為229.3，白色晶體，易溶于水(24 ℃下每升可溶0.9 mol)，硫咪唑氨基酸(thiol-imidazole amino acids)類天然抗氧化劑，參與維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的氧化還原態(tài)[1]。1909年，Tanret等[2]首次從寄生于禾本植物黑麥的麥角真菌分離出L-EGT，隨后在人類血液中發(fā)現(xiàn)L-EGT，從而引起了人們的關(guān)注。生理?xiàng)l件下，L-EGT主要以硫酮的形式存在，保持穩(wěn)定性，使其不易發(fā)生自氧化(見圖1)。由于L-EGT特殊結(jié)構(gòu)，它具有比谷胱甘肽更高的穩(wěn)定性和抗氧化活性[3]。研究表明，L-EGT具有預(yù)防和治療由氧化脅迫而引起的癌癥、心血管疾病、認(rèn)知功能障礙等疾病的潛力以及生鮮食品的保鮮和防腐[4-16]。2016年，歐洲食品安全局發(fā)布了L-EGT作為新型食品的安全性評估聲明[4]，為L-EGT相關(guān)醫(yī)藥以及食品的開發(fā)拓寬了道路。基于L-EGT的強(qiáng)抗氧化性、安全性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，使其在化妝品、功能食品、醫(yī)療、治療學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

圖1 L-EGT的互變異構(gòu)體

1 L-麥角硫因的生物合成

L-EGT最初是1909年Tanret等[2]從麥角真菌中分離得到，并認(rèn)為L-EGT分布于分生孢子中而不是菌核。

1956年、1957年及1958年Heath和Wildy連續(xù)用[2-14C]乙酸鹽標(biāo)簽法[17]、[35S]標(biāo)記蛋氨酸及用[2(環(huán))-14C]標(biāo)記組胺標(biāo)簽法[18]、組氨酸標(biāo)簽法[19]確認(rèn)了組氨酸、蛋氨酸是合成L-EGT的前體。1959年Melville等[20]在同位素標(biāo)記前體的幫助下，研究了粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)生物合成L-EGT三甲基銨基團(tuán)的途徑；推測L-EGT的生物合成順序?yàn)椋航M氨酸經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用合成組氨酸甜菜堿再經(jīng)半胱氨酸巰基化作用合成L-EGT。Ishikawa等人用粗糙鏈孢霉無細(xì)胞提取物催化組氨酸的α-氨基氮原子甲基化，推測N-二甲基組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化α-N-甲基組氨酸、α-N形成組氨酸三甲內(nèi)鹽，其中，二甲基組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)組氨酸轉(zhuǎn)化為組氨酸三甲內(nèi)鹽的三個(gè)轉(zhuǎn)氨甲基化反應(yīng)[21,22]。

在藍(lán)細(xì)菌和厭氧綠硫細(xì)菌中，L-EGT的合成途徑由兩個(gè)酶EanA和EanB構(gòu)成[27,28](圖2中“∧”標(biāo)記部分)。組氨酸在EanA酶的作用下轉(zhuǎn)化為組氨酸三甲內(nèi)鹽，通過EanB酶直接催化生成L-EGT。而在一些真菌中，如粗糙鏈孢霉、裂殖酵母、煙曲霉菌及膠紅酵母四種小型真菌的L-EGT合成途徑與恥垢分枝桿菌、藍(lán)細(xì)菌和厭氧綠硫細(xì)菌均不相同[29,30]，該途徑由Egt1和Egt2兩個(gè)合成酶構(gòu)成[31-33](圖2中“&”標(biāo)記部分)。在這四種真菌中，Egt1將三個(gè)甲基從s-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移到組氨酸中形成組氨酸三甲內(nèi)鹽，并利用氧和半胱氨酸進(jìn)一步催化組氨酸三甲內(nèi)鹽生成海西烯半胱氨酸亞砜，最后通過Egt2催化生成L-EGT[35]。此外，真菌L-EGT生物合成途徑還免除了γ-谷氨?；?半胱氨酸的參與，從而消除了L-EGT和谷胱甘肽之間的生物合成競爭，極大提高了L-EGT的生物合成效率[36]。這些研究表明，自然界微生物的L-EGT生物合成途徑是多樣的，可能還存在著一些未知L-EGT生物合成方式。

圖2 微生物L(fēng)-EGT的生物合成途徑

2 麥角硫因的攝取、代謝及分泌

植物、動(dòng)物和人均不能合成L-EGT，只能從其他來源獲取L-EGT。植物可吸收土壤微生物合成的L-EGT，而動(dòng)物和人可從食物中獲取L-EGT[37]。人體中L-EGT的主要膳食來源是蘑菇、某些品種的黑豆和紅豆、內(nèi)臟和谷物[38-40]。在所有的L-EGT來源中，食用菌的L-EGT含量最為豐富，但不同種類的食用菌的含量各異(見表1)。根據(jù)歐洲食品安全局估計(jì)，歐洲人群中蘑菇約占飲食攝入L-EGT含量的95%[15]。一些研究發(fā)現(xiàn)，膳食中L-EGT的含量對動(dòng)物和人組織的L-EGT含量具有顯著的影響。Kato等[41]分析了小鼠口服3H標(biāo)記的L-EGT(濃度為330 ng/kg bw)后的放射性分布?？诜o藥4 h后，小腸上、中段的放射性濃度最高。14天后，放射性濃度最高的區(qū)域發(fā)生了改變，放射性水平依次為肝臟>腎>紅細(xì)胞>腸。在大鼠的研究中，也觀察到了類似的組織分布，即腹腔注射14C標(biāo)記的L-EGT 4～5 h后，在肝臟中檢測到20%～30%的放射性，且放射性主要集中非蛋白組織部分。同樣的，在大鼠靜脈注射3H標(biāo)記的L-EGT24 h后，放射性水平依次為肝臟>腎>脾臟>肺>血液>睪丸>血漿。在10～19天內(nèi)，大鼠口服35S標(biāo)記的L-EGT后，發(fā)現(xiàn)肝臟的放射性水平最高，其次是血細(xì)胞和腎臟。

表1 常見食用菌L-麥角硫因含量

在脊椎動(dòng)物中，有一種稱為有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的跨膜蛋白OCTN1(organic cation transporter 1)。通過分析大鼠和不同人體組織中的OCTN1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA水平[42,43]以及OCTN1敲除小鼠證明了OCTN1是L-EGT特異轉(zhuǎn)運(yùn)體[44]。哺乳動(dòng)物通過OCTN1轉(zhuǎn)運(yùn)體從胃腸道的食物中吸收L-EGT。由于不同組織中的OCTN1的mRNA表達(dá)差異，進(jìn)而影響著L-EGT在各個(gè)組織和器官中分布不均。

L-EGT在各器官和組織的代謝周轉(zhuǎn)率較低。Mayumi等[48]發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射16 mg/kg bw的L-EGT，給藥1周后，血液和肝臟中的L-EGT濃度呈線性增加。腹腔注射L-EGT后2周期間，L-EGT并沒有或只是少量地從肝臟或紅細(xì)胞中清除。在10名中國男性受試者中，血漿中L-EGT隨著服用劑量和時(shí)間的增加而增加，在隨后的4周內(nèi)，全血中L-EGT濃度持續(xù)升高，并在4周左右趨于平穩(wěn)。

在大鼠肝中，L-EGT濃度隨著鼠齡的增長而增加，在11周時(shí)達(dá)到最大值[49]。同樣，大鼠[50]和人類[51]紅細(xì)胞中L-EGT隨著年齡的增長而增加。雌性大鼠在出生后的第一個(gè)月到第三個(gè)月期間，它的水平增加了兩倍，然后保持不變；而雄性大鼠的水平則在18個(gè)月期間一直上升[52]。

3 麥角硫因的應(yīng)用研究

3.1 麥角硫因在食品中的應(yīng)用

因L-EGT良好的抗氧化性，具有良好的食品保鮮效果。研究表明，用L-EGT溶液處理采后雙孢蘑菇，可減緩其褐變和延長貨架期[53]。Bao等[45]從金針菇中提取L-EGT水溶液可抑制大眼金槍魚肉高鐵血紅生產(chǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT水溶液可防止牛肉和金槍魚肉的脂質(zhì)過氧化，保持其色澤鮮艷[5]。利用金針菇提取的L-EGT水溶液可防止鮮蝦黑變病的發(fā)生以及抑制蝦肉的脂質(zhì)過氧化[9]。用L-EGT水溶液處理新鮮的紅海鯉和日本海鱸魚，可保持其品質(zhì)，延長紅海鯉和日本海鱸魚的貨架期[6,7]。此外，在低溫條件下，富含L-EGT的蘑菇提取液可抑制鮭魚肌肉組織的脂質(zhì)氧化，保持肌肉組織色澤鮮艷[11]。2016年，歐盟發(fā)布了L-EGT作為食品添加劑安全聲明，為L-EGT在食品防腐保鮮中的應(yīng)用拓寬了道路[54]。

3.2 麥角硫因在日化中的應(yīng)用

3.3 麥角硫因在醫(yī)療中的應(yīng)用

3.3.1 麥角硫因的抗氧化性

3.3.2 麥角硫因螯合金屬離子

L-EGT具有螯合二價(jià)陽離子的功能。例如，L-EGT可與Cu2+、Fe2+、Zn2+、Hg2+、Co2+、Ni2+、Cd2+等金屬陽離子形成配合物，并防止這些金屬離子參與ROS的形成[63]。此外，L-EGT可保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)免受Cu2+誘導(dǎo)的氧化損傷[64]。研究表明，在動(dòng)物和人類中，高水平的L-EGT可以防止Cu2+對精子活力的抑制[65]。此外，與GSH在Cu2+存在下易生成活性氧ROS(通過形成具有氧化還原活性的Cu(I)-[GSH]2配合物)相比，L-EGT與Cu2+的配合物相對穩(wěn)定，不易分解生成自由基[66]。

3.3.3 神經(jīng)保護(hù)作用

神經(jīng)元氧化應(yīng)激與抑郁癥、阿爾茲海默癥、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病息息相關(guān)。許多研究表明，L-EGT可以保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞抵御多種氧化脅迫損傷。早先，人們在小鼠與大鼠的大腦中檢測到L-EGT轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1 mRNA的表達(dá)[67]。與此同時(shí)，在不同小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、貓、羊和牛等動(dòng)物大腦中檢測到不同水平的L-EGT，表明L-EGT是可以穿過血腦屏障[68]。利用PC12細(xì)胞(用于神經(jīng)生物學(xué)研究的細(xì)胞模型)研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT通過清除該細(xì)胞中的過氧亞硝基，從而抑制Aβ淀粉樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[69]。另一項(xiàng)細(xì)胞內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，廣譜抗癌藥Cisplatin能顯著降低PC12細(xì)胞的增殖，強(qiáng)烈抑制PCN(初級表皮神經(jīng)元)細(xì)胞軸突和樹突的生長，但L-EGT能顯著抑制這些作用[70]。L-EGT還可抑制由Cisplatin引起的抗細(xì)胞增殖效應(yīng)，恢復(fù)小鼠皮層神經(jīng)元生長[71]。與Cisplatin和Aβ作用類似，過度刺激NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體能引發(fā)自由基的產(chǎn)生，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，而腹腔注射L-EGT可顯著抑制因注射NMDA引起的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損失[72]。L-EGT還可促進(jìn)大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞分化[73]。此外，在小鼠FST(強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn))和TST(懸尾實(shí)驗(yàn))中，口服L-EGT可提高小鼠大腦L-EGT水平，促進(jìn)神經(jīng)元分化以及減輕抑郁癥狀[74]。

3.3.4 在慢性炎癥中的作用

越來越多的證據(jù)表明許多慢性疾病與慢性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。而細(xì)胞中重要的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通過介導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)控機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)。Kos等[75]研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT可顯著下調(diào)7-酮基膽固醇誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3中促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和COX2的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)。此外，Rahman等[76]研究表明，L-EGT可抑制H2O2和TNFα介導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞A549中NF-κB的激活和IL-8表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)。富含L-EGT的雞腿菇(Coprinuscomatus)提取物可清除髓過氧化物酶(MPO)產(chǎn)生的次氯酸(HOCl)和次溴酸(HOBr)以及抑制UV-B誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[77]。在C2C12細(xì)胞中，L-EGT通過抑制P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及降低炎癥因子IL6水平，減少炎癥反應(yīng)，從而抵御棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[78]。

在克羅恩氏病(Crohn’s disease，腸道炎癥性疾病)患者以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，L-EGT的抗炎作用存在著爭議。在2004年，Peltekova等[79]研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1第503個(gè)氨基酸發(fā)生突變(即503L突變?yōu)?03F)突變與克羅恩氏病有關(guān)，隨后研究發(fā)現(xiàn)，OCTN1 503F變體比正常503L變體的L-EGT轉(zhuǎn)運(yùn)能力提高了50%。與正常個(gè)體相比，克羅恩氏病患者體內(nèi)OCTN1 mRNA表達(dá)與L-EGT含量均顯著上升。用炎癥因子TNFα處理Caco2細(xì)胞可誘導(dǎo)TNFα受體TNFR1介導(dǎo)的OCTN1 mRNA表達(dá)上調(diào)[80]。然而，與之相反，Kato等[41]發(fā)現(xiàn)日本克羅恩氏病患者的血液L-EGT濃度顯著低于正常個(gè)體；隨后他們利用OCTN1敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，缺乏L-EGT的動(dòng)物容易發(fā)生腸道炎癥，因此提示L-EGT可能在抗腸道炎癥中發(fā)揮作用。此外，在輕度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的紅細(xì)胞和單核細(xì)胞L-EGT水平顯著升高[81]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠在炎癥關(guān)節(jié)的血液學(xué)和免疫學(xué)組織中也高表達(dá)OCTN1[82]。因此，L-EGT在克羅恩氏病以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用仍然有待于進(jìn)一步研究。

3.3.5 在子癇前期中的作用

3.3.6 在心血管中的作用

L-EGT的免疫調(diào)節(jié)作用有助于抑制促炎細(xì)胞因子以及粘附分子引起動(dòng)脈粥樣硬化。研究表明，L-EGT可降低人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的表達(dá)，抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮的結(jié)合[88]。利用缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)模型大鼠研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT可降低IR模型大鼠血清AST、ALT和LDH水平，抑制脂質(zhì)過氧化以及上調(diào)熱休克蛋白HSP70水平，從而防止IR引起的肝臟損傷[89]。在大鼠腸系膜IR模型中研究發(fā)現(xiàn)，L-EGT通過提高HSP70水平，降低TNF-α、IL-1β、MDA和MPO含量，從而減輕腸系膜IR損傷，并改善因IR損傷后的形態(tài)學(xué)改變[90]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，金屬螯合劑可以抑制自由基產(chǎn)生，緩解IR損傷，暗示L-EGT還可通過螯合金屬離子減輕IR損傷[91]。然而，Cargnoni等[92]研究發(fā)現(xiàn)，服用L-EGT并不能保護(hù)兔子心臟IR損傷，而導(dǎo)致該結(jié)果可能原因是兔子服用L-EGT是在IR之前的60 min，組織尚未很好地吸收L-EGT，致L-EGT不能發(fā)揮保護(hù)IR損傷的作用。

Zn元素對人體儲存胰島素和糖原重要作用。早期的調(diào)查顯示，糖尿病患者體內(nèi)的L-EGT水平升高，而L-EGT可螯合Zn離子，因而認(rèn)為L-EGT是糖尿病發(fā)病的元兇之一[7]。然而，四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)L-EGT水平升高，且L-EGT處理并沒有影響含Zn金屬酶的活性。另外一項(xiàng)研究顯示，小鼠成肌細(xì)胞中，L-EGT可抑制由棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗及2型糖尿病相關(guān)的IL6表達(dá)[93]。此外，補(bǔ)充L-EGT可降低患糖尿病的妊娠大鼠因高血糖依賴性的氧化脅迫而引起的胚胎畸形率[94]。

4 總結(jié)與展望

L-EGT是一種高效、安全、穩(wěn)定的天然抗氧化劑，具有良好的自由基清除能力、螯合二價(jià)陽離子功能以及食品保鮮防腐功效。人體通過細(xì)胞膜表面有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體OCTN1吸收L-EGT，保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、保護(hù)皮膚免受紫外脅迫等[95]。但人體從食物中獲取L-EGT有限，而市面上L-EGT價(jià)格高昂，限制了人們額外補(bǔ)充L-EGT。目前化學(xué)方法合成L-EGT困難，且存在產(chǎn)品安全性難以保證、合成原料及成本高昂等缺點(diǎn)。從富含L-EGT的食用菌中提取存在提取效率低、耗費(fèi)時(shí)間長、難以大規(guī)模制備等問題，依然不能從根源上解決L-EGT產(chǎn)量不足。當(dāng)前已經(jīng)解析了細(xì)菌和真菌的L-EGT生物合成途徑，未來應(yīng)當(dāng)利用基因工程手段構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)L-EGT工程菌，并結(jié)合現(xiàn)代化綠色低碳發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)L-EGT規(guī)?；a(chǎn)，從根本上降低L-EGT生產(chǎn)成本。

鑒于L-EGT具有預(yù)防和治療癌癥、心血管疾病、認(rèn)知功能障礙等疾病的潛力，但缺乏有力的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對L-EGT臨床試驗(yàn)研究。