HPLC指紋圖譜結(jié)合多模式化學(xué)計量學(xué)方法評價枳殼藥材質(zhì)量

李 燦，曾 娟，龍雨青，周新茹，楊 敏，童巧珍，周日寶*，劉湘丹*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點研究室，長沙 410208

枳殼為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種黃皮酸橙(C.aurantium‘huangpi’)、代代花(C.aurantium‘daidai’)、朱欒(C.auramium‘zhuluan’)、塘橙(C.aurantium‘tangcheng’)的干燥未成熟果實，7月果皮尚綠時采收[1]。枳殼性微寒，味苦、辛、酸，具有理氣寬中，行滯消脹功效[1]。我國枳殼根據(jù)分布地域和主栽品種分為湘枳殼、川枳殼、江枳殼和浙產(chǎn)枳殼(蘇枳殼和溫枳殼)4類。湘枳殼的基原植物主要為黃皮酸橙；川枳殼的基原植物主要為酸橙；江枳殼的基原植物主要為臭橙；蘇枳殼的基原植物為代代酸橙(代代花)；溫枳殼基原植物為朱欒[2]。枳殼的化學(xué)成分主要為黃酮類、揮發(fā)油、香豆素類及少量的生物堿類[3]。黃酮類化合物為枳殼主要有效成分，且以柚皮苷、新橙皮苷為代表的二氫黃酮化合物在藥理藥效中起著重要作用，如抗氧化、抗炎抑菌、改善腸胃動力障礙等[3-5]，不同產(chǎn)地的枳殼藥材的柚皮苷和新橙皮苷含量存在差異[6]。

枳殼來源品種眾多，受產(chǎn)地、采收時間及貯藏條件等因素影響，導(dǎo)致其活性成分及含有量相差甚遠(yuǎn)，市場上枳殼商品藥材的質(zhì)量不穩(wěn)定，從而直接影響枳殼的臨床療效。目前對枳殼藥材的質(zhì)量控制主要集中在柚皮苷和新橙皮苷的含量測定上，通過查閱文獻可見，大多采用高效液相色譜法[7-9]建立柚皮苷和新橙皮苷的含量測定方法?？紤]到中藥活性成分的復(fù)雜多樣性，柚皮苷和新橙皮苷作為枳殼檢測指標(biāo)已經(jīng)不夠全面，不能滿足社會發(fā)展對藥品質(zhì)量控制越來越高的要求。中藥指紋圖譜是運用一定綜合性的分析方法，通過特征性色譜圖或光譜圖，在整體上對其化學(xué)特征進行表征，是目前被公認(rèn)為最有效的綜合性評價中藥整體質(zhì)量的技術(shù)手段之一。本研究建立11份枳殼藥材的高效液相色(HPLC)指紋圖譜，測定13個化學(xué)成分的含有量，采用多模式化學(xué)計量法對其質(zhì)量進行全面評價，旨在為枳殼藥材的質(zhì)量評價及控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ME204E/02電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Eco-S15實驗室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)；中草藥粉碎機(天津市泰式特儀器有限公司)；BCD-452WDPF冰箱(青島海爾服務(wù)有限公司)。

1.2 試藥

對照品圣草次苷(批號18040305，純度≥98%)、新北美圣草苷(批號20090801，純度為99.87%)、蕓香柚皮苷(批號20080401，純度為99.91%)、柚皮素(批號19110604，純度為99.87%)、橙皮素(批號18010204，純度≥98%)、橙皮內(nèi)酯(批號21012202，純度為99.01%)、川陳皮素(批號18070602，純度≥98%)購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；對照品柚皮苷(批號H24N9Z75896，純度≥98%)、橙皮苷(批號K09S11L123847，純度≥98%)、新橙皮苷(批號Z31J6L2067，純度≥98%)購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；對照品枸橘苷(批號AF9062201，純度≥98%)、桔皮素(批號AF9092506，純度≥98%)、橙皮油素(批號AF20100403，純度≥98%)購于成都埃法生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純(安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；甲醇為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；磷酸為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 藥材

11份枳殼藥材，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為蕓香科柑橘屬植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實。藥材具體信息見表1，藥材樣品圖見圖1。

圖1 枳殼樣品圖片

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Supersil ODS-B100A色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脫(0～20 min，20% A；20～25 min，20%→60% A；25～40 min，60%→90% A；40～50 min，90% A)；體積流量為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長284 nm。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素對照品適量，加75%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.165、0.985、1.400、4.296、1.685、3.038、0.700、0.254、0.097、0.477、0.454、0.208、0.231 mg/mL的混合對照品溶液，密封，低溫避光保存，備用。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過80目藥典篩)約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL濃度為75%的甲醇，稱定質(zhì)量，使用超聲波儀在25 ℃水浴下提取30 min，超聲后靜止至上液澄清，補足損失重量，取上清液0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

取枳殼藥材樣品(S5)，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，進行色譜分析，記錄色譜圖。以柚皮苷為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間的RSD在0.05%～0.10%，相對峰面積的RSD在0.08%～1.48%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取枳殼藥材樣品(S5)粉末6份，每份稱取1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以柚皮苷為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間的RSD在0.07%～1.08%，相對峰面積的RSD在1.65%～3.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取枳殼藥材樣品(S5)供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。以柚皮苷為參照峰，測得16個共有峰相對保留時間的RSD在0.05%～0.30%，相對峰面積的RSD在0.32%～1.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 參照峰選擇

在各批枳殼樣品色譜圖中柚皮苷分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定柚皮苷為參照峰。

2.5 枳殼藥材指紋圖譜的建立及相似度分析

取表1中11批枳殼藥材，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2012A版)，設(shè)置S1為參照圖譜，對照圖譜生成方法為中位數(shù)法，多點校正后進行色譜峰匹配，得到11份枳殼樣品的HPLC指紋圖譜(見圖2)，并生成對照圖譜(見圖3)。結(jié)果表明共獲得16個共有峰，通過對照品的色譜圖和保留時間，與樣品色譜圖進行比對，指認(rèn)12個共有峰：1號峰為圣草次苷，2號峰為新北美圣草苷，3號峰為蕓香柚皮苷，4號峰為柚皮苷，5號峰為橙皮苷，7號峰為新橙皮苷，9號峰為枸橘苷，10號峰為柚皮素，11號峰為橙皮素，12號峰為橙皮內(nèi)酯，14號峰為川陳皮素，15號峰為桔皮素。11份枳殼藥材供試品色譜圖與對照指紋圖譜相似度見表2，結(jié)果顯示11份樣品相似度在0.992～0.999，表明11份枳殼藥材相似度良好，化學(xué)成分種類較穩(wěn)定。

圖2 枳殼樣品HPLC指紋圖譜圖

圖3 枳殼對照指紋圖譜

表2 枳殼樣品相似度評價結(jié)果

2.6 枳殼藥材中13種成分含量測定

2.6.1 色譜條件

色譜條件同“2.1”項，色譜圖見圖4。

圖4 混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC圖

2.6.2 線性關(guān)系考察

取“2.2”項下混合對照品溶液適量，稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以測得的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進行線性回歸計算，結(jié)果見表3。

表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.6.3 精密度試驗

取枳殼藥材樣品(S5)，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，進行色譜分析，記錄色譜圖。測得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮油內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.21%、0.17%、0.17%、0.09%、0.16%、0.15%、1.48%、0.12%、0.13%、0.12%、0.11%、0.08%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗

取枳殼藥材樣品(S5)粉末6份，每份稱取1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。測得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮油內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.97%、0.53%、1.79%、2.78%、0.46%、0.33%、0.59%、0.67%、0.40%、1.44%、1.42%、0.33%、0.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗

取枳殼藥材樣品(S5)供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。測得圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素、橙皮油內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.78%、0.35%、1.14%、1.27%、0.34%、0.41%、1.76%、0.41%、0.44%、0.74%、0.45%、0.40%、0.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的枳殼樣品(S5)6份，約0.5 g，分別精密加入適量對照品溶液，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率(按干燥品計算)，結(jié)果見表4，結(jié)果表明該方法的回收率良好。

表4 枳殼回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.6.7 樣品含量測定

稱取11份枳殼樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取各供試溶液10 μL，按“2.3”項下色譜條件進行測定，計算樣品中各成分的百分含量(按干燥品計算)，結(jié)果見表5。

表5 枳殼藥材多成分含量測定結(jié)果

2.7 基于化學(xué)計量學(xué)對不同產(chǎn)地枳殼藥材13種化學(xué)成分的比較與分析

2.7.1 聚類分析(HCA)

以11份枳殼藥材中13個化學(xué)成分含量為變量，運用SPSS 22數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，采用組間聚類方法，歐氏距離平方法測量樣品間距離進行系統(tǒng)聚類分析(見圖5)。結(jié)果表明，以距離小于5為標(biāo)準(zhǔn)，將11份枳殼藥材分為4類，S1、S3、S4、S8聚為第一類；將S2、S5、S6、S9、S10聚為第二類；S11聚為第三類；S7聚為第四類。

圖5 枳殼的系統(tǒng)聚類分析

2.7.2 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析

主成分分析法(principal component analysis)是一種通過降維技術(shù)把多個變量化為少數(shù)幾個主成分(綜合變量)的統(tǒng)計分析方法。這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，它們通常表示為原始變量的某種線性組合。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，其最大的特點是可以除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息主要集中在一個主成分，使模型更簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[10]。

將枳殼中13種化學(xué)成分含量導(dǎo)入SPSS 22數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，以特定的特征值與累計貢獻率作為判定依據(jù)，對11份枳殼藥材進行主成分分析。以特征值>2為提取標(biāo)準(zhǔn)，11份枳殼藥材有3個主成分，其特征值λ1=6.315，λ2=2.974，λ3=2.013，特征值λ1的貢獻率為48.576%，λ2的貢獻率為22.878%，λ3的貢獻率為15.486%，累積貢獻率為86.940%>85%，故選取前3個主成分進行評價，其代表枳殼中13個成分含量86.940%的信息量，具有良好的代表性，可以反映枳殼的綜合質(zhì)量。

以選取的主成分方差貢獻率為權(quán)重系數(shù)，對11份枳殼藥材主成分得分、綜合得分進行分析，根據(jù)得分系數(shù)矩陣結(jié)果得PC1、PC2、PC3及綜合得分線性表達式，如下：

PC1=0.116BX1-0.097BX2+0.152BX3+0.129BX4+0.113BX5+0.055BX6+0.15BX7-0.04BX8-0.077BX9+0.045BX10+0.136BX11+0.113BX12+0.128BX13

PC2=0.2BX1+0.152BX2+0.08BX3+0.04BX4-0.077BX5-0.272BX6+0.006BX7+0.273BX8+0.243BX9-0.092BX10+0.127BX11+0.16BX12-0.032BX13

PC3=-0.048BX1+0.253BX2-0.012BX3+0.066BX4+0.318BX5+0.176BX6-0.008BX7+0.192BX8+0.192BX9+0.421BX10+0.073BX11-0.185BX12-0.052BX13

綜合得分(F)=0.48576×PC1+0.71454×PC2+0.8694×PC3

BX1、BX2、BX3、BX4、BX5、BX6、BX7、BX8、BX9、BX10、BX11、BX12、BX13分別代表圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、橙皮內(nèi)酯、川陳皮素、桔皮素、橙皮油素的含量。

通過以上表達式得各地區(qū)的綜合得分，并對得分結(jié)果進行排序(見表6)。得分情況反映各地區(qū)枳殼藥材質(zhì)量情況，質(zhì)量越好，則分?jǐn)?shù)越高。本研究中，湖南湘潭藥材得分最高，質(zhì)量較好。

表6 枳殼主成分得分、綜合得分及排名

將枳殼中13種化學(xué)成分含量導(dǎo)入SIMCA多元變量統(tǒng)計軟件，得到PCA得分圖、OPLS-DA得分圖和VIP圖。結(jié)果見圖6、7、8。結(jié)果表明，采用PCA和OPLS-DA來觀察樣品的自然聚集，11份樣品同樣也聚為4類，且分離更加顯著，與HCA結(jié)果一致。

圖6 不同枳殼樣品的PCA得分圖

結(jié)合變量重要性投影(VIP)法，以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的4個質(zhì)量標(biāo)志物，分別為柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、枸橘苷。所測13個化學(xué)成分影響程度由大到小依次為：柚皮苷>蕓香柚皮苷>橙皮苷>枸橘苷>新橙皮苷>新北美圣草苷>川陳皮素>橙皮油素>桔皮素>圣草次苷>橙皮內(nèi)酯>橙皮素>柚皮素。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本實驗考察了不同濃度甲醇(50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)提取效果，結(jié)果表明用75%甲醇提取的樣品效果最佳，故本研究選擇75%甲醇為提取溶劑。

3.2 流動相系統(tǒng)的選擇

本實驗考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液的流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明0.1%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫時色譜峰峰形較好，分離度較高，因此本研究選用乙腈-0.1%磷酸水溶液做為流動相。

圖7 不同枳殼樣品的PCA得分圖

圖8 枳殼13個化學(xué)成分的VIP值

3.3 枳殼藥材質(zhì)量影響因素的討論

化學(xué)模式識別的方法與指紋譜圖分析相結(jié)合，能準(zhǔn)確判別出枳殼樣品之間的差異，可以初步作為考察商品藥材質(zhì)量優(yōu)劣的判別標(biāo)準(zhǔn)[11]。本研究基于枳殼藥材樣品中13個化學(xué)成分含量結(jié)果，進行了聚類分析、主成分分析和判別分析，分析發(fā)現(xiàn)所研究的11份枳殼藥材樣品的質(zhì)量不一。根據(jù)聚類結(jié)果可知不同產(chǎn)地也聚為一類，說明不同產(chǎn)地的枳殼質(zhì)量較為均一，沒有明顯地域性，這是由于湖南、江西、浙江都屬于長江流域以南地區(qū)，其地理、氣候、土壤環(huán)境相似。根據(jù)表6綜合得分排名的結(jié)果可知，湖南產(chǎn)的臭橙品種質(zhì)量優(yōu)于黃皮酸橙，而黃皮酸橙品種質(zhì)量優(yōu)于代代花，從柚皮苷、新橙皮苷(藥典規(guī)定的指標(biāo)成分)質(zhì)量百分含量結(jié)果可知，枳殼不同品種新橙皮苷的質(zhì)量百分含量較為一致，黃皮酸橙和臭橙品種的柚皮苷質(zhì)量百分含量高于代代花，說明品種為影響枳殼藥材質(zhì)量的重要因素之一。枳殼來源中有較多的栽培變種品種，且枳殼用藥歷史悠久，有1700年的種植歷史，經(jīng)歷多次品種變遷，基源問題自古以來就比較復(fù)雜，造成其品種的質(zhì)量差異可能與長期的自然選擇和人工選育有關(guān)。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC法建立了11份枳殼藥材樣品的指紋圖譜，并結(jié)合定量分析、相似度評價、主成分分析及判別分析對11份枳殼藥材樣品進行質(zhì)量評價，該方法簡便準(zhǔn)確，可用于枳殼藥材的綜合質(zhì)量評價。不同產(chǎn)地枳殼均為柚皮苷和新橙皮苷質(zhì)量百分含量高；HPLC指紋圖譜有16個共有峰，11份枳殼藥材相似度良好，不同產(chǎn)地來源枳殼藥材質(zhì)量較穩(wěn)定；從綜合得分排名結(jié)果可知，湖南湘潭所產(chǎn)枳殼綜合得分較高，說明其質(zhì)量較佳；從VIP值結(jié)果可知，以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、枸橘苷4個質(zhì)量標(biāo)志物。