趙嘉璐 李偉文 藍(lán)偉紅 藍(lán)秀 熊雪芳 孫蕾
肺癌是一種預(yù)后極差的高度惡性腫瘤疾病,按照WHO肺癌的病理學(xué)分類可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌,而非小細(xì)胞肺癌在臨床中更為常見[1]。近些年來(lái),無(wú)論是外科技術(shù)的提高或放化療方案的優(yōu)化,還是針對(duì)肺癌驅(qū)動(dòng)基因的分子靶向治療的問(wèn)世,包括已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)等,都未能使肺癌患者的5年生存率明顯提高(仍然低于15%)[2],因此尋找新的治療靶點(diǎn)和療法對(duì)提高患者生存率有著重要意義。
胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和惡性轉(zhuǎn)化方面起著至關(guān)重要的作用,其生物活性受胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白家族(insulin-like growth factor binding protein,IGFBPs)調(diào)節(jié)。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4(IGFBP-4)為最小的IGFBP,是一個(gè)重要的抑制蛋白,與IGF具有高親和力[3],近些年的大量研究表明,IGFBP-4在多種腫瘤的生長(zhǎng)調(diào)控中都表現(xiàn)出了極其重要的作用,其主要通過(guò)結(jié)合組織自分泌的IGF從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[4-8]。目前,IGFBP-4在肺癌中的表達(dá)及作用尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中IGFBP-4的表達(dá)情況,并觀察其對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,初步探討其可能的作用機(jī)制,為肺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。A549細(xì)胞置于含10%FBS、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人重組 IGFBP-4(美國(guó) R&D 公司,批號(hào):804-GB),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、膜封閉液和ECL發(fā)光液(美國(guó)Thermo公司)。兔抗人IGFBP-4單抗(美國(guó)R&D公司,批號(hào):AF804),鼠抗人Fibronectin單抗(美國(guó)Santa公司),鼠抗人c-fos單抗(英國(guó)Abcam公司),鼠抗人β-actin單抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗(中國(guó)聯(lián)科生物公司)。CCK-8試劑盒(日本Dojin公司)。
1.2 組織樣本采集 收集麗水市中心醫(yī)院2008年1月至2020年1月行手術(shù)治療的20例非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織和正常肺組織(腫瘤邊緣5 cm外的肺組織,并經(jīng)組織病理切片檢查證實(shí)),組織樣本均為手術(shù)后立即采集,所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療。組織病理類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO肺癌的病理學(xué)分類。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。
1.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8法。使用96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,各孔接種A549細(xì)胞濃度為2 000個(gè)。將A549細(xì)胞分為Control組和不同濃度IGFBP-4(5、50、500 ng/ml)處理組。4組細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后,Control組不做任何處理,其余3組采用不同濃度的IGFBP-4處理細(xì)胞,分別在1、2、3和4 d時(shí)加入10 μl CCK-8溶液,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀下選擇波長(zhǎng)450 nm測(cè)定各孔吸光度,根據(jù)各組細(xì)胞的吸光度值繪制4 d的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。選出細(xì)胞增殖活性最佳的細(xì)胞組進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
1.4 細(xì)胞集落形成 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞以500個(gè)細(xì)胞的密度分別接種含10 ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,用IGFBP-4 500 ng/ml處理,并在RPMI1640中孵育14 d形成細(xì)胞集落。采用考馬斯藍(lán)染色后對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行成像,計(jì)算克隆形成的細(xì)胞集落數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。
1.5 細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的檢測(cè)
1.5.1 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。消化A549細(xì)胞,離心(800 r/min)棄上清液,用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室,24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后取出Transwell小室,4%多聚甲醛固定后0.1%結(jié)晶紫染色,用棉簽擦去上層未遷移細(xì)胞,隨機(jī)觀察6個(gè)視野細(xì)胞并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。
1.5.2 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。將 Matrigel 1∶3稀釋,取10 μl鋪于 Transwell小室底部膜的上室面成膠。消化A549細(xì)胞,離心(800 r/min)棄上清液,用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml。取細(xì)胞懸液 200 μl加入 Transwell小室,24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培養(yǎng)基,置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出 Transwell小室,4%多聚甲醛固定后0.1%結(jié)晶紫染色。用棉簽擦去上層未遷移細(xì)胞,隨機(jī)觀察 6個(gè)視野細(xì)胞并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。
1.6 IGFBP-4、Fibronectin和c-fos表達(dá)水平檢測(cè) 采用 Western blot法。收集肺癌組織(T)、正常肺組織(N)標(biāo)本及A549細(xì)胞(Control組和IGFBP-4組),提取蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取40 μg蛋白樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉,一抗4℃孵育過(guò)夜,TBST緩沖液洗膜,加二抗室溫孵育,再用TBST緩沖液洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光顯色,凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光,檢測(cè)IGFBP-4、Fibronectin和c-fos蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,取平均值。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá) IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá)水平為0.50±0.19,正常組織中表達(dá)水平為1,IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。
圖1 肺癌組織和正常組織IGFBP-4表達(dá)的電泳圖
2.2 IGFBP-4對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 生長(zhǎng)曲線顯示,A549細(xì)胞經(jīng)50、500 ng/ml IGFBP-4處理后增殖活性明顯低于 Control組(均 P<0.05),見圖 2a。與Control組相比,用500 ng/ml IGFBP-4處理的A549細(xì)胞中形成的細(xì)胞集落數(shù)量為(65.33±17.47)個(gè),明顯低于 Control組的(149.66±25.50)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 2b。
圖2 IGFBP-4對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(a:4組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,與Control組比較,*P<0.05;b:兩組細(xì)胞集落數(shù)量的比較)
2.3 IGFBP-4對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響與Control組比較,用500 ng/ml IGFBP-4處理的A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低(均P<0.05),見圖3(插頁(yè))、表1。
表1 兩組細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較(個(gè))
圖3 A549細(xì)胞遷移和侵襲圖像(a:細(xì)胞遷移;b:細(xì)胞侵襲;結(jié)晶紫染色,×200)
2.4 IGFBP-4對(duì)A549細(xì)胞Fibronectin和c-fos蛋白表達(dá)水平的影響 在500 ng/ml IGFBP-4處理48 h后,與Control組相比,IGFBP-4下調(diào)Fibronectin和c-fos蛋白的表達(dá)水平(均 P<0.05),見圖 4、表 2。
圖4 兩組細(xì)胞Fibronectin和c-fos蛋白表達(dá)的電泳圖
表2 兩組細(xì)胞Fibronectin和c-fos蛋白表達(dá)水平的比較
IGFBPs由6種不同的蛋白成員(IGFBP1-6)組成,對(duì)IGF-1和IGF-2有很高的抑制作用[9]。IGFBP-4作為最小的成員,已被證實(shí)是一個(gè)重要的抑制蛋白,與IGF具有高親和力[3],存在于所有的生物體液中,由不同類型的細(xì)胞合成以自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮作用,其生理功能主要由參與調(diào)解IGF的經(jīng)典途徑和不依賴于IGF的非經(jīng)典途徑構(gòu)成[10]。IGFBP-4主要是與胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGF而調(diào)節(jié)IGF的生物學(xué)作用,從而在各種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,大量研究的顯示,其主要通過(guò)結(jié)合IGF從而發(fā)揮抗腫瘤作用[4-8]。
作為IGFBPs的一個(gè)重要成員,IGFBP-4已成為許多惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)[3,11-12]。研究表明,IGFBP-4可以抑制結(jié)直腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[13-15]。雖然IGFBP-4作為抑癌基因被逐漸認(rèn)識(shí),但其在肺癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不明確。本研究采用Western blot法檢測(cè)20例肺癌組織及鄰近正常組織中IGFBP-4蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào),且前期研究表明IGFBP-4能促使肺癌細(xì)胞凋亡[16],結(jié)果提示在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中IFGBP-4可能扮演著重要角色。同時(shí),筆者觀察IGFBP-4對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)IGFBP-4處理的A549細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲能力明顯低于Control組,說(shuō)明IGFBP-4在肺癌中可能作為抑癌基因抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
Fibronectin即纖粘連蛋白,是一種與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的重要的細(xì)胞蛋白。Fibronectin的表達(dá)隨著腫瘤惡性程度的增高而增強(qiáng),與腫瘤的分級(jí)及預(yù)后有關(guān)[17-18]。眾所周知,c-fos原癌基因被描述為一種即時(shí)的早期反應(yīng)基因,其中c-fos的高表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤的形成,反映細(xì)胞的增殖活性,與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),IGFBP-4顯著降低Fibronectin和c-fos蛋白的表達(dá),這些結(jié)果表明IGFBP-4可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展中潛在的負(fù)調(diào)節(jié)因子,通過(guò)下調(diào)Fibronectin和c-fos表達(dá)在肺癌的增殖中起著關(guān)鍵作用。
總之,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)IGFBP-4在肺癌組織中的表達(dá)明顯降低,發(fā)現(xiàn)IGFBP-4抑制腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制可能主要通過(guò)下調(diào)Fibronectin和c-fos的表達(dá),說(shuō)明IGFBP-4在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用,并可能為未來(lái)肺癌的治療提供新的思路。