利用CRISPR/Cas9技術構建MLH1基因敲除結腸癌細胞Mc38和乳腺癌細胞4T1及其微衛(wèi)星狀態(tài)鑒定

劉名安, 李輝嚴, 李建明*, 柳玉紅

(1.南方醫(yī)科大學 第二臨床醫(yī)學院， 廣東 廣州 510000； 2.深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 病理科， 廣東 深圳 518101; 3.中山大學 孫逸仙紀念醫(yī)院 病理科， 廣東 廣州 510120)

CRISPR序列最早是1987年在大腸桿菌基因組中發(fā)現的，但是直到2007年它們對噬菌體的保護作用才被證實[1-2]。CRISPR 基因座存儲了病原菌的基因信息，是微生物適應性免疫系統(tǒng)的一部分。在CRISPR之前，基因編輯系統(tǒng)包括鋅指核酸酶(ZFNs)系統(tǒng)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs)系統(tǒng)。由于其相對簡單和適應性，CRISPR已迅速成為最流行的基因組工程方法。2013年，Cong等[3]利用CRISPR/Cas9技術在人類和小鼠細胞內實現了精準的基因編輯，并構建了可同時靶向多個位點的基因編輯系統(tǒng)，這極大地推進了基因編輯技術在生命科學領域的應用。

微衛(wèi)星(micro satellite，MS)是基因組中一種小于10 bp的簡單重復序列[4]，又叫短串聯重復(short tandem repeat，STR)，是一類呈高度多態(tài)的遺傳標記，用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷；這些簡單重復序列在DNA復制過程中容易出現“鏈滑”現象，導致重復單元的重復次數出現波動，即重復單元的插入與刪除，從而導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定的形成。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(micro satellite instability，MSI)是由DNA錯配修復蛋白表達缺失引起的一種超可變表型[5]。錯配修復蛋白系統(tǒng)由一系列酶組成，主要包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白，這些酶檢測S期DNA復制錯誤并加以修正，保證了DNA復制的保真性[6-8]。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤錯配修復蛋白表達缺失，錯配修復系統(tǒng)的修復功能受損，無法修復DNA復制時出現的堿基互補配對錯誤，這種錯誤逐漸在基因組DNA序列上積累，形成了突變負荷的物質基礎[9]，堿基突變積累程度高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤有著更顯著的免疫細胞浸潤豐度和免疫檢查點阻斷劑療效[10-11]。檢測腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)可以預測腫瘤患者抗腫瘤免疫治療的反應，且越來越多的免疫檢查點阻斷劑被批準用于微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者的抗腫瘤免疫治療[12-15]。但是，僅有一小部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者在免疫檢查點阻斷劑的治療方案中受益[16]，微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤廣泛預后的具體機制尚未完全明了。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建MLH1基因敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定鼠源性結腸癌細胞Mc38和乳腺癌細胞4T1兩種細胞模型，為后續(xù)深入研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤在抗腫瘤免疫治療過程中的作用機制提供工具和手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與細胞

CRISPR/Cas9骨架質粒lentiCRISPRv2(Plasmid #52961)，慢病毒包裝骨架質粒pMD2.G(Plasmid #12259)和psPAX2(Plasmid #12260)，鼠源性結直腸癌細胞系Mc38、乳腺癌細胞系4T1由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院李建明教授課題組提供。

1.1.2 主要試劑

SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術有限公司)、RIPA裂解液(強)(碧云天生物技術有限公司)、PMSF磷酸酶抑制劑(50×)(碧云天生物技術有限公司)、PierceTMBCA Protein Assay(賽默飛世爾科技公司)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(碧云天生物技術有限公司)、蛋白marker(賽默飛世爾科技公司)、Antibody to GAPDH(武漢三鷹生物技術有限公司)、HRP標記抗兔IgG(美國Jaskson公司)、HRP標記抗小鼠IgG(美國Jaskson公司)、Ra EPR38bbit monoclonal to MLH1(英國abcam公司)、Cas9 (S. pyogenes) (D8Y4K) Rabbit mAb(英國abcam公司)、DL15000 DNA Marker(3582A)、GelRed無毒核酸染料(41003)、2 × Taq Master Mix (Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、Polybrene聚凝胺(H8761)、嘌呤霉素(0219453925)、無內毒素質粒小提中量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。

1.1.3 主要儀器

細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)、純水儀(默克生命科學有限公司)、超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)、小型低溫離心機(德國Eppendorf公司)、PCR儀(德國Eppendorf公司)、金屬煮樣器、制冰機(Scotsman公司)、流式分選儀、水浴鍋、電子天平(Mettler Toledo公司)、光學顯微鏡、水平搖床(Kylin-Bell公司)、高壓滅菌鍋、電泳儀(BioRad公司)、瓊脂糖水平電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(Tanon公司)、酶標儀、蛋白印跡成像系統(tǒng)(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 SgRNA序列設計

利用 NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索鼠源性MLH1基因(ID：17350)信息。利 用 Zhang lab 實 驗 室 網 站(https://zlab.bio/guidedesign-resources)設計特異性靶向MLH1基因的SgRNA序列；根據SgRNA設計網站計算得分，選取兩條特異性靶向MLH1基因的SgRNA序列，SgRNA1：ATTGGCAAGCATAAGCCATG，SgRNA2：GGGCACCCTGATCACGGTGA。其中，SgRNA1序列特異性靶向MLH1基因的第四號外顯子，SgRNA2序列特異性靶向MLH1基因的第五號外顯子末端部分堿基序列及其后面部分內含子堿基序列(圖1)。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列。

圖1 MLH1基因敲除示意圖Figure 1 Schematic diagram of MLH1 gene knockout strategy

1.2.2 lentiCRISPRv2-SgRNA載體的構建

使用BsmBⅠ限制性內切酶酶切質粒lentiCRISPRv2并切膠回收。合成的寡核苷酸單鏈SgRNA用T4多聚核苷酸激酶退火形成二聚體，用T4連接酶將SgRNA二聚體與酶切的lentiCRISPRv2質粒連接，然后將連接產物體系轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，涂于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，挑取單個菌落搖菌，菌液提取質粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定，測序引物為：hU6-F(5-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3)。將lentiCRISPRv2-SgRNA重組質粒載體分別和慢病毒包裝骨架質粒 pMD2.G、psPAX2共轉染293T細胞構建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體，轉染48 h后收集細胞上清，按照慢病毒純化試劑說明書純化慢病毒。

1.2.3 MLH1-/-混合克隆腫瘤細胞的構建及鑒定

用lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體分別感染Mc38細胞和4T1細胞，因載體中帶有Cas9分子量較大的蛋白，表達時間較長，培養(yǎng)至第10天，Mc38細胞和4T1細胞分別在含有6 μg/mL和3 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中生長至無大量細胞死亡后，更換含有半致死量嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。提取細胞總蛋白，經Western Blot檢測Cas9蛋白和MLH1蛋白的表達，篩選MLH1-/-混合克隆腫瘤細胞并保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮環(huán)境中。

1.2.4 MLH1-/-單克隆腫瘤細胞的篩選及鑒定

收集并制作MLH1-/-混合克隆腫瘤細胞單細胞懸液，經96孔板流式分選制備含有單個細胞的培養(yǎng)體系，擴大培養(yǎng)后，收集單克隆細胞提取細胞蛋白和基因組DNA，進行Western Blot、PCR和測序鑒定，篩選MLH1-/-單克隆腫瘤細胞并保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮環(huán)境中。SgRNA1引物(5′-3′，700 bp)：CCCTGTGGTAGCAGCATGAA(上游)和CCAGCAGATCAAAGAGGCCA(下游)；SgRNA2引物(5′-3′，300 bp)：GCCACTAGG-CCTGTACTGTG(上游)和CGCCATGCCATAAAA-CCCAA(下游)。

1.2.5 MLH1-/-單克隆腫瘤細胞系微衛(wèi)星檢測

鼠源性微衛(wèi)星檢測位點信息(表1)；收集連續(xù)培養(yǎng)約70 d的MLH1-/-單克隆腫瘤細胞送生工生物工程(上海)股份有限公司進行熒光PCR-毛細管電泳鑒定細胞微衛(wèi)星狀態(tài)。

表1 小鼠腫瘤MSI檢測標志物信息Table 1 Mice tumor MSI detection marker information

2 結果

2.1 lentiCRISPRv2-SgRNA質粒載體的鑒定

構建的MLH1基因敲除lentiCRISPRv2-SgRNA質粒載體進行一代測序獲得基因堿基序列，經過比對，構建的質粒載體分別含有設計的靶點序列SgRNA1和SgRNA2，證明本研究成功構建了MLH1基因敲除lentiCRISPRv2-SgRNA1和lentiCRISPRv2-SgRNA2質粒載體(圖2)。

A：SgRNA1序列；B：SgRNA2序列A: SgRNA1 sequence；B: SgRNA2 sequence圖2 質粒載體鑒定結果Figure 2 Results of plasmid vector identification

2.2 MLH1-/-混合克隆腫瘤細胞蛋白表達情況

慢病毒敲除載體感染細胞后，經過嘌呤霉素篩選得到MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細胞，通過蛋白免疫印跡技術，檢測Cas9蛋白和MLH1蛋白驗證得到的MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細胞慢病毒感染情況和MLH1基因敲除的情況；實驗結果顯示，感染組表達了Cas9蛋白(未感染慢病毒組不見Cas9蛋白表達)，感染組的MLH1蛋白表達較未感染慢病毒組明顯下降，證明慢病毒已經成功感染細胞，且成功構建MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細胞系(圖3)。

A：鼠源性腸癌Mc38細胞Cas9蛋白的表達；B：鼠源性乳腺癌4T1細胞Cas9蛋白的表達；C：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA1的作用下的表達；D：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA2的作用下的表達；E：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA1的作用下的表達；F：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA2的作用下的表達A: Expression of Cas9 protein in murine intestinal cancer MC38 cells；B: Expression of Cas9 protein in murine breast cancer 4T1 cells；C: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA1;D: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA2;E: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA1;F: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA2圖3 混合克隆腫瘤細胞蛋白表達情況Figure 3 Protein expression of mixed clone tumor cells

2.3 MLH1-/-單克隆腫瘤細胞蛋白表達情況

MLH1基因敲除混合克隆腫瘤細胞，經過96孔板流式分選技術得到含有單個細胞的培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)，通過蛋白免疫印跡技術，挑選MLH1蛋白完全敲除的單克隆腫瘤細胞系；實驗結果顯示，感染組部分單克隆腫瘤細胞系較未感染組MLH1蛋白完全不表達，從蛋白水平證明本研究成功構建MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞系，包括MLH1基因敲除單克隆腸癌Mc38細胞系和MLH1基因敲除單克隆乳腺癌4T1細胞系(圖4)。

A：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA1的作用下的表達；B：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA2的作用下的表達；C：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA1的作用下的表達；D：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA2的作用下的表達A: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA1;B: Expression of MLH1 gene in murine intestinal cancer MC38 cells under the action of target SgrNA2;C: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA1;D: Expression of MLH1 gene in murine breast cancer 4T1 cells under the action of target SgrNA2圖4 單克隆腫瘤細胞蛋白表達情況Figure 4 Protein expression in monoclonal tumor cells

2.4 MLH1-/-單克隆腫瘤細胞MLH1基因敲除情況

提取MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞的基因組DNA，經PCR擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小和進行一代測序檢測基因組DNA片段的堿基序列；結果顯示，瓊脂糖凝膠上DNA電泳條帶大小分別為700 bp和300 bp左右，與設計的引物PCR片段大小一致，靶點SgRNA1前后引物在野生型MLH1基因組PCR片段大小為700 bp，靶點SgRNA2前后引物在野生型MLH1基因組PCR片段大小為300 bp；其中，26#單克隆細胞出現PCR引物的非特異性結合條帶(圖5D)。分析基因組DNA片段一代測序結果的峰圖，一致為單峰的峰圖結果和瓊脂糖凝膠上單一的DNA電泳條帶的結果，表明Cas9蛋白酶作用于兩條同源染色體同一位置，并且機體以同樣的堿基修復Cas9蛋白酶的剪切缺口，得到了在兩條同源染色體基因編輯位點上堿基序列一致的MLH1基因敲除的單克隆腫瘤細胞系。通過比對一代測序結果的堿基序列和MLH1基因野生型堿基序列，可以知道MLH1基因靶向SgRNA序列具體的基因編輯位點(圖6、7)和基因編輯堿基序列的改變；因為在Cas9蛋白酶切割DNA雙鏈斷裂后由非同源末端連接途徑(NHEJ)進行修復，所以得到基因編輯堿基序列不一致性的多個單克隆基因敲除細胞系。以上結果表明本研究構建的MLH1基因敲除的單克隆腫瘤細胞系在基因水平得到了驗證。(圖5-7，表2)

表2 小鼠腸癌細胞Mc38和乳腺癌細胞4T1突變位點序列信息Table 2 Sequence information of mutant sites of mouse colorectal cancer cell MC38 and breast cancer cell 4T1

A：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段；B：鼠源性腸癌Mc38細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段；C：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段；D：鼠源性乳腺癌4T1細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段A: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA1 in murine colorectal cancer MC38 cells；B: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA2 in murine colorectal cancer MC38 cells；C: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA1 in murine breast cancer 4T1 cells；D: DNA fragment of MLH1 gene at target SgrNA2 in murine breast cancer 4T1 cells圖5 單克隆腫瘤細胞MLH1基因組DNA片段Figure 5 The MLH1 genomic DNA fragment of monoclonal tumor cells

A：鼠源性腸癌Mc38-56#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點；B：鼠源性腸癌Mc38-61#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點；C：鼠源性腸癌Mc38-5#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點；D：鼠源性腸癌Mc38-20#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點；E：鼠源性腸癌Mc38-33#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點；(▼為DNA片段堿基缺失位點)圖6 單克隆腫瘤細胞Mc38-MLH1基因組DNA片段堿基缺失位點Figure 6 Base deletion sites of Mc38-MLH1 genomic DNA fragments in monoclonal tumor cells

A：鼠源性乳腺癌4T1-8#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點；B：鼠源性乳腺癌4T1-50#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA1處的DNA片段堿基缺失位點；C：鼠源性乳腺癌4T1-1#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點；D：鼠源性乳腺癌4T1-26#單克隆細胞MLH1基因在靶點SgRNA2處的DNA片段堿基缺失位點；(▼為DNA片段堿基缺失位點)圖7 單克隆腫瘤細胞4T1-MLH1基因組DNA片段堿基缺失位點Figure 7 Base deletion sites of 4T1-MLH1 genomic DNA fragments in monoclonal tumor cells

2.5 MLH1-/-單克隆腫瘤細胞微衛(wèi)星分析

據文獻報道，野生型鼠源性腸癌Mc38細胞系[11]和野生型鼠源性乳腺癌4T1細胞系[17]均為微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤細胞系，因此，本研究選取Mc38細胞系和4T1細胞系作為研究對象。人類基因組序列和小鼠基因組序列不完全一致，小鼠有著自己獨立的微衛(wèi)星檢測位點，均為單堿基簡單重復序列；根據小鼠微衛(wèi)星位點信息，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成熒光引物，并上機檢測樣品微衛(wèi)星狀態(tài)；根據微衛(wèi)星不穩(wěn)定判斷準則，檢測5個微衛(wèi)星位點中，有大于等于2個位點片段大小發(fā)生改變，則判斷該樣品微衛(wèi)星狀態(tài)為不穩(wěn)定；當位點片段大小改變在兩條同源染色體上一致時，相比于對照組的微衛(wèi)星穩(wěn)定樣品的微衛(wèi)星檢測峰圖，實驗組的微衛(wèi)星檢測峰圖僅會出現位置的偏移，主要體現為微衛(wèi)星檢測峰圖主峰位置的偏移；當位點片段大小改變在兩條同源染色體上不一致時，相比于對照組的微衛(wèi)星穩(wěn)定樣品的微衛(wèi)星檢測峰圖，實驗組的微衛(wèi)星檢測峰圖不僅會出現位置的偏移，還會出現峰圖數量的變化，即同源染色體等位基因雜合子的情況[18-21]。數據顯示，MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞Mc38-56#、4T1-26# 5個微衛(wèi)星檢測位點的檢測峰值較野生型腸癌細胞的均發(fā)生了位置的偏移(表3、4)。

表3 野生型腸癌細胞與MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞Mc38-56#微衛(wèi)星比對Table 3 Comparison of microsatellite between wild-type colorectal cancer cells and MLH1 knockout monoclonal tumor cells MC38-56 #

表4 野生型乳腺癌細胞和MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞4T1-26#微衛(wèi)星比對Table 4 Comparison of microsatellite between wild-type breast cancer cells and MLH1 knockout monoclonal tumor cells 4T1-26#

3 討論

為了解決科學研究單一性的問題，本研究在MLH1基因序列上設計了2條SgRNA，其中SgRNA1序列特異性靶向MLH1基因的第四號外顯子，SgRNA2序列特異性靶向MLH1基因的第五號外顯子末端部分堿基序列及其后面部分內顯子堿基序列；SgRNA的設計和選擇是CRISPR/Cas9基因編輯技術特異性靶向編輯基因特定位點序列的導航系統(tǒng)，同時也為后期驗證基因編輯變化提供了可循的依據。利用SgRNA分別構建重組質粒載體lentiCRISPRv2-SgRNA后，與慢病毒包裝骨架質粒pMD2.G、psPAX2共轉染293T細胞構建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒載體；實驗室前期將重組質粒載體lentiCRISPRv2-SgRNA轉染導入腸癌細胞Mc38和乳腺癌細胞4T1，多次均未獲成功，利用慢病毒系統(tǒng)感染細胞，很好地解決了外源大分子質粒轉染效率低下這個技術難題，同時慢病毒系統(tǒng)不僅提高了感染效率也提高了敲除效率。利用質粒載體lentiCRISPRv2自帶的嘌呤霉素抗性和流式分選系統(tǒng)篩選陽性單克隆細胞。PCR及DNA測序結果表明陽性細胞株第四號外顯子/第五號外顯子成功敲除，Western Blot 結果證明陽性細胞株中MLH1蛋白表達完全缺失。至此，本研究共獲取9株MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞， 其中腸癌Mc38細胞5株(敲除第四號外顯子的2株，敲除第五號外顯子的3株)，乳腺癌4T1細胞4株(敲除第四號外顯子的2株，敲除第五號外顯子的2株)。

微衛(wèi)星是廣泛分布于基因組中單個、兩個、3個甚至更多個的串聯重復核苷酸序列。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的產生是由于DNA錯配修復系統(tǒng)(MMR)缺陷導致的微衛(wèi)星序列丟失或增加，它與MMR基因的缺失表達相關。錯配修復系統(tǒng)由一系列酶組成，包括：MLH和MSH兩大家族，主要的家族成員分別有MLH家族的MLH1、MLH3、PMS1、PMS2和MSH家族的MSH2、MSH3、MSH6，這些酶檢測S期DNA復制錯誤并修正DNA復制錯誤，保證了DNA復制的保真性；MMR蛋白以異二聚體結構維持蛋白穩(wěn)定性，常見的異二聚體組合主要有：MSH2-MSH6、MSH2-MSH3、MLH1-PMS2、MLH1-PMS1、MLH1-MLH3，MSH2異二聚體組合和MLH1異二聚體組合聯合發(fā)揮修復DNA復制錯誤的功能，從異二聚體組合可以看出，MSH2和MLH1蛋白的正常表達，絕對的影響了機體錯配修復功能的執(zhí)行，一旦缺失MLH1或者MSH2，細胞DNA復制出現的錯誤將無法修正。錯配修復蛋白的缺失導致了錯配修復功能無法執(zhí)行DNA復制出現的堿基配對錯誤，這種錯誤隨著DNA復制合成新的DNA子鏈而不斷地發(fā)生并保存在新合成的子鏈中[6-8]。對于錯配修復蛋白表達缺失的腫瘤，需要進一步設計熒光PCR-毛細管電泳實驗檢測特定微衛(wèi)星位點序列的情況，明確腫瘤微衛(wèi)星狀態(tài)。人類微衛(wèi)星位點檢測中，分別擴增5個單核苷酸重復標志物和2個五核苷酸重復標志物，其中5個單核苷酸重復標志物分別為 NR-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、MONO-27，這些標志物均為準單態(tài)性，即群體中幾乎所有個體該位點為同一等位基因純合狀態(tài)，2個五核苷酸重復標志物為Penta D和Penta E，具有較高的多態(tài)性和較低的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，用于判斷腫瘤組織和正常組織是否來源于同一個患者。

本研究構建的9株MLH1基因敲除單克隆腫瘤細胞分別為鼠源性腸癌細胞和鼠源性乳腺癌細胞，人類基因組序列和小鼠基因組序列不完全相同，因此，人類基因組微衛(wèi)星檢測的位點不能用于小鼠微衛(wèi)星檢測。小鼠有著自己獨立的微衛(wèi)星檢測位點，均為單核苷酸重復標志物，分別為mBat64(A64)、AC096777(T27)、AA003063(A23)、U12235(A24)、L24372(A27)。本研究對獲取的9株單克隆腫瘤細胞在體外進行為期70 d的連續(xù)培養(yǎng)后，選取MLH1基因敲除腸癌Mc38細胞5#、33#、56#、61#單克隆和乳腺癌4T1細胞26#單克隆進行熒光PCR-毛細管電泳實驗檢測細胞微衛(wèi)星狀態(tài)，陽性克隆微衛(wèi)星檢測結果分別與Mc38-WT細胞和4T1-WT細胞檢測結果進行對比，顯示本研究成功構建MLH1基因敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定鼠源性腸癌細胞Mc38和鼠源性乳腺癌細胞4T1。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤，由于錯配修復功能缺失，導致了基因組DNA序列的突變積累，形成了突變負荷的物質基礎[9]；同時，這種基因組DNA序列上的突變積累轉錄后翻譯成更多的新蛋白，形成了更多的腫瘤新抗原，為抗腫瘤免疫治療提供了理論支持[22]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤由于缺失基因組錯配修復功能，這種微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤獨特的特征是否會影響腫瘤內一些重要信號通路分子相關基因和一些重要免疫分子相關基因DNA復制的保真性及其免疫激活的機制尚未可知。通過敲除細胞錯配修復蛋白中的MLH1蛋白，構建微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細胞系，再移植到動物模型，模擬再現人類微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的情況，為探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的免疫浸潤模式和對微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的抗腫瘤免疫治療進行實驗研究提供了物質基礎。

研究表明，僅有一小部分微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者在免疫檢查點阻斷劑的治療方案中受益[16]，現有的免疫檢查點阻斷劑抗腫瘤免疫治療方案更多關注的是T細胞在抗腫瘤免疫治療中的作用[23-29]，對于抗原提呈細胞[30-31]、自然殺傷細胞[32-33]和腫瘤相關性巨噬細胞[34-35]等其他免疫細胞抗腫瘤免疫治療中的重要作用也逐漸被揭示。同時，現有的免疫檢查點阻斷劑抗腫瘤免疫治療方案更多的是批準用于轉移性腫瘤患者，這一類腫瘤患者，腫瘤已經通過血液途徑和(或)淋巴途徑轉移到了其他的臟器，對于全身免疫的激活有著非常重要的作用，那么，對于尚未形成轉移的腫瘤患者，反應更多的是局部免疫的激活，是通過自身腫瘤抗原的高表達和分泌的淋巴因子，對免疫激活進行調控；研究表明，腫瘤外泌體上的PD-L1表達有著免疫抑制的作用，同時，也有著更好的免疫檢查點阻斷劑治療的臨床效益[36-37]。對于尚未轉移的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤患者，探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤外泌體在抗腫瘤免疫治療的機制有著非常重要的意義。

本研究構建的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細胞系，為探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤包括T細胞在內的免疫浸潤模式、有顯著差異的免疫浸潤細胞在抗腫瘤免疫治療的作用、微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤外泌體抗腫瘤免疫激活的機制、微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤轉移瘤抗腫瘤免疫激活的機制提供了動物實驗模型的物質基礎；同時，本研究構建的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤細胞，錯配修復蛋白MLH1蛋白表達缺失，可以進一步分析MLH1蛋白敲除的微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤的免疫相關分子的變化，如PD-L1受體和MHC受體的表達水平變化，為研究微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤免疫激活的作用機制提供了細胞模型基礎。

作者貢獻聲明

劉名安：實驗操作、統(tǒng)計分析數據，撰寫論文；李輝嚴：提供載體；柳玉紅：申請課題，實驗設計，修改論文；李建明：提出研究思路和框架，實驗指導。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。