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      基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用機(jī)制

      2022-05-05 08:47:24王振龍韓育英張秀麗李佳鳳沈阿靈
      福建中醫(yī)藥 2022年4期
      關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)移性黃芩靶點(diǎn)

      王振龍 ,韓育英 ,張秀麗 ,李佳鳳 ,沈阿靈 *,彭 軍 *

      (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)老年病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122;3.閩江師范高等專科學(xué)校,福建 福州 350122;4.福建省婦幼保健院,福建福州350001)

      乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一,2020年全球新發(fā)病例數(shù)高達(dá)226 萬,病死率占所有惡性腫瘤的6.9%,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。研究表明乳腺癌致死的最主要原因就是發(fā)生耐藥及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2],可見,防治轉(zhuǎn)移性乳腺癌對(duì)提高患者預(yù)后和延長生存期有著重要意義,進(jìn)一步尋找能夠有效抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物迫在眉睫。

      中醫(yī)藥因其具有多成分、多靶點(diǎn)和整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn),可通過多靶點(diǎn)、多通路產(chǎn)生治療效果,在臨床腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用,特別是從天然植物中尋找低毒性、高抗癌活性的化合物單體備受青睞[3]。黃芩苷是一種從傳統(tǒng)中藥黃芩中分離得到的活性黃酮類化合物,在抗腫瘤等方面有著諸多積極作用,對(duì)乳腺癌亦有抑制作用[4-7],而對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的調(diào)控機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)層面的研究。因此,本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究黃芩苷、作用靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌之間的關(guān)系,探討黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

      1 方 法

      1.1 黃芩苷的成藥性檢驗(yàn) 以“Baicalin”作為檢索詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)[8]獲得黃芩苷的藥代動(dòng)力學(xué)(AD?ME)等數(shù)據(jù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18 作為黃芩苷的成藥性檢驗(yàn)依據(jù)[9],獲取黃芩苷化合物的MOL2 文件,用于后續(xù)黃芩苷的作用靶點(diǎn)預(yù)測。

      1.2 黃芩苷的作用靶點(diǎn)預(yù)測 將“1.1”獲取的黃芩苷的 MOL2 文件導(dǎo)入到Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫(http://lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/)[10],選擇最大生成的構(gòu)象(maximum generated conformations)為“1 000”,選擇目標(biāo)(select targets set)設(shè)定為人類蛋白質(zhì),獲取黃芩苷的潛在作用靶點(diǎn)。然后,將獲得的潛在作用靶 點(diǎn)導(dǎo) 入 Uniplot 數(shù)據(jù) 庫(https://www.uniprot.org/)[11]轉(zhuǎn)化成統(tǒng)一的基因名,設(shè)置基因來源為人源性,從而獲得黃芩苷的作用靶點(diǎn)。

      1.3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)的獲取 以“Metastatic breast cancer”為檢索詞在Gene?Cards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[12]檢索相關(guān)疾病靶點(diǎn),以相關(guān)性得分(relevance score)≥中位數(shù)作為篩選條件獲得轉(zhuǎn)移性乳腺癌的的疾病靶點(diǎn)。利用 Venny 2.1.0 的在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)與黃芩苷的作用靶點(diǎn)相映射,得到黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn),即是黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)。

      1.4 共同靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI 網(wǎng)絡(luò))構(gòu)建與分析 將黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)[13]“multi?ple proteins”檢索欄中,物種設(shè)置為“homo sapiens”,選擇置信度>0.7,其余的參數(shù)保持為默認(rèn)設(shè)置,以獲取相互作用關(guān)系信息表。將PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為“tsv”格式文件,然后將文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件建立PPI 網(wǎng)絡(luò),同時(shí)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析,以“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Cen?trality”3 個(gè)指標(biāo)均大于中位數(shù)作為篩選條件,獲取具有拓?fù)渲匾缘陌悬c(diǎn),定義為黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn)[14]。

      1.5 GO 和KEGG 富集分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DA?VID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[15]進(jìn)行 GO 和KEGG 富集分析。以P<0.01、錯(cuò)誤發(fā)生率(FDR)<0.01 作為篩選依據(jù),獲取黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的信號(hào)通路及生物學(xué)過程。并且依據(jù)富集基因數(shù)從多到少進(jìn)行排序,篩選出KEGG 富集分析結(jié)果中排名前10 的信號(hào)通路及GO 富集分析結(jié)果中排名前10 的生物學(xué)過程。

      2 結(jié) 果

      2.1 黃芩苷的成藥性檢驗(yàn) 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得了黃芩苷(PubChem CID:64982)的藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)數(shù)據(jù),如:黃芩苷的分子量(MW)=446.39 da、口服生物利用度(OB)=40.12%、類藥性(DL)=0.75 等,由黃芩苷 MW<500 da、DL>0.18、OB>30%表明黃芩苷與已知藥物相似,具有成藥性。

      2.2 黃芩苷的作用靶點(diǎn) 利用Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入黃芩苷(Molecule ID:MOL002776)的MOL2文件獲取412 個(gè)黃芩苷的潛在作用靶點(diǎn),使用Uniplot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化成統(tǒng)一的基因名,去除重復(fù)項(xiàng),獲得399 個(gè)黃芩苷的作用靶點(diǎn)。

      2.3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn) 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫共收集獲得了轉(zhuǎn)移性乳腺癌的6 377 個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn),經(jīng)篩選獲得3 188 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將黃芩苷的作用靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的疾病靶點(diǎn)分別輸入Venny 2.1.0 在線工具分析,得到共同靶點(diǎn)(即是黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn))206 個(gè),并用 Cytoscape 軟件作圖,見圖 1。

      圖1 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用靶點(diǎn)

      2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將黃芩苷與轉(zhuǎn)移性乳腺癌共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中,獲得一個(gè)206 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 063 條邊的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖,見圖 2。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到:“Degree”中位數(shù)為 9、“Closeness Centrality”中位數(shù)為 0.373 966 942 148 76 和“Betweenness Cen?trality”中位數(shù)為 0.002 112 449 542 506 35,經(jīng)篩選獲得具有拓?fù)渲匾园悬c(diǎn)(即黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn))62 個(gè),包含絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)、靶向調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0α 編碼基因(HSP90AA1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、GTP 酶(HRAS)、表皮生長因子受體(EGFR)、促生長因子(IGF1)、雌激素受體α(ESR1)、酪氨酸蛋白激酶(JAK2)、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)等,見圖3。

      圖2 共同作用靶點(diǎn)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

      圖3 黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

      2.5 GO 富集分析 運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)的206 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析(P<0.01),獲取209 個(gè)基因本體條目,其中生物過程(BP)相關(guān)條目134 個(gè),主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、蛋白磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、MAPK 級(jí)聯(lián)、血管生成等方面;分子功能(MF)的相關(guān)條目51 個(gè),主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇激素受體活性、ATP 結(jié)合等方面;細(xì)胞成分(CC)的相關(guān)條目24 個(gè),主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、胞外外泌體等方面。并根據(jù)富集基因數(shù)由多到少進(jìn)行排序,篩選出排名前10 名,使用GraphPad prism 制圖軟件制作可視化柱狀圖,見圖4。

      圖4 共同靶點(diǎn)的GO 富集分析圖

      2.6 KEGG 通路分析 運(yùn)用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌相關(guān)的206 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析(P<0.01),獲得具有顯著性的信號(hào)通路88 條,并且依據(jù)富集基因數(shù)從多到少進(jìn)行排序,排名前10 名的信號(hào)通路,見表1。由表1 可知:這些共同靶點(diǎn)主要富集在癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等信號(hào)通路。

      3 討 論

      本研究結(jié)果顯示:黃芩苷可能通過調(diào)控癌癥的途徑、PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、Rap1 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等發(fā)揮對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療作用,其中多條均被證實(shí)參與乳腺癌的疾病進(jìn)展[16-17]。拓?fù)渲匾园悬c(diǎn)及信號(hào)通路主要通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、蛋白水解、基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡、增殖、遷移等過程實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的調(diào)控。

      PI3K/Akt 信號(hào)通路是惡性腫瘤最常見的異常調(diào)控通路之一,其功能失調(diào)性活化與乳腺癌臨床預(yù)后不良密切相關(guān)[16-17]。PI3K 是生長因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要組成部分,激活后的PI3K 可引起下游蛋白磷酸化,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[18]。有研究表明:PI3K/Akt 信號(hào)通路磷酸化可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[19],并主要與 Src、PI3K、Akt 蛋白的磷酸化水平密切相關(guān)[20]。Akt 亦屬 PI3K 的下游直接靶蛋白,參與調(diào)控細(xì)胞增殖及代謝,促進(jìn)纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成[21],可調(diào)節(jié)下游包括凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等多種生物過程[22]。AKT1 與 HSP90AA1作用密切相關(guān),而HSP90AA1 可影響乳腺癌的生存期長短[23]。血漿的HSP90AA1 可抑制腫瘤細(xì)胞增值和轉(zhuǎn)移[24],在乳腺癌組織中比正常組織的表達(dá)明顯增高,可用于預(yù)測乳腺癌的發(fā)生和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[25]。另外,Akt 還可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白來促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[26],下調(diào)E-鈣黏蛋白及上調(diào)N-鈣黏蛋白,使其獲得了不同的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài),表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞骨架重構(gòu),可能觸發(fā)多種細(xì)胞因子、生長因子,使細(xì)胞的游走能力大大提高,并增強(qiáng)了與周邊間質(zhì)組織的親和能力,腫瘤細(xì)胞進(jìn)而得以擴(kuò)散以及轉(zhuǎn)移。因此,本研究預(yù)測黃芩苷可作用于這些相互作用密切的靶點(diǎn)PI3K、AKT1、HSP90AA1、SRC,調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等生物過程,進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

      絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等細(xì)胞生理活動(dòng),該通路的關(guān)鍵因子有 Ras、Raf、MEK 和 ERK 蛋白,與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前公認(rèn)的機(jī)制是一旦Ras-MAPK/ERK 信號(hào)通路活化異常,可導(dǎo)致自身突變激活,被上游信號(hào)持續(xù)激活,進(jìn)而激活下游的蛋白,造成血管形成、細(xì)胞增殖、凋亡抑制等,最終造成腫瘤的產(chǎn)生與進(jìn)展。MAPK 信號(hào)通路的上游是 Ras/Raf 蛋白,下游包括 p38、c-Jun N 端激酶(JNK)與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)等,而在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)可檢測到ERK 的活性異常增高[27]。ERK屬于MAPK 亞家族成員,ERK 信號(hào)通路可下調(diào)抗凋亡蛋白B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),上調(diào)促凋亡因子、Bax 及p38,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,起到抑制癌癥的作用[7]。另外,MAPK-mTOR 信號(hào)通路中通過調(diào)節(jié)mTOR、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 及p38等的表達(dá),促進(jìn)微管相關(guān)蛋白LC3(LC3-Ⅱ)和自噬基因-1(Beclin-1)的表達(dá),可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。因此,本研究結(jié)果預(yù)示黃芩苷可能通過調(diào)控MAPK、Bcl-2 等核心作用靶點(diǎn)的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡,發(fā)揮治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用。

      目前,轉(zhuǎn)移性乳腺癌病死率高且易復(fù)發(fā),特別棘手的一種是三陰性乳腺癌,具體為雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體2(HER2)陰性。其中,HER2 是 EGFR 成員之一,研究表明EGFR 具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,可調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞的黏附與遷移[29]。EMT 是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)展的關(guān)鍵步驟[30],TGF-β1 能夠誘導(dǎo) EMT,增強(qiáng)體外乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[31],TGF-β 誘導(dǎo)的 EMT 又可被抑制活化的p38 促分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)所阻斷。有趣的是,本研究結(jié)果顯示黃芩苷治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌可能涉及的癌癥的途徑、MAPK 通路、癌癥中的蛋白多糖、FoxO 信號(hào)通路均有EGFR、TGF-β 的參與。由此可見,EGFR 與 Akt、MAPK、TGF-β 等靶點(diǎn)之間復(fù)雜交互作用,共同調(diào)控EMT,進(jìn)而影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

      綜上所述,本研究結(jié)果表明:黃芩苷可能基于PI3K/Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等核心信號(hào)通路,以及調(diào)控HSP90AA1、PIK3R1、Akt、SRC、MAPK、EGFR 和 TGF-β 等重要靶點(diǎn)之間復(fù)雜交互作用,從而發(fā)揮治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的作用,具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探討或通過實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

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