綠原酸對(duì)煙草疫霉的抑制作用及對(duì)煙草黑脛病的防治效果研究

張?jiān)サ?馬曉寒 李俊領(lǐng) 許自成 賈 瑋 石秋環(huán)

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450002，河南鄭州；2河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，471003，河南洛陽(yáng)）

煙草黑脛病（tobacco black shank，TBS）俗稱煙草疫病，由寄生煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）引起，屬于世界性煙草病害，也是我國(guó)煙草最嚴(yán)重的病害之一，在各個(gè)煙區(qū)均有發(fā)生[1-3]。煙草疫霉菌是典型的土傳病原真菌，以菌絲或厚垣孢子的形式長(zhǎng)期寄生在植物病殘?bào)w或土壤中，可存活數(shù)年[4]。一旦遇到適宜的生長(zhǎng)條件，便會(huì)萌發(fā)并釋放出大量的游動(dòng)孢子，并通過(guò)植物氣孔和傷口等侵入到煙株的根、莖、葉等部位[3]。目前，TBS的防治手段主要包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、抗病育種和生物防治。單一化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期過(guò)度施用會(huì)導(dǎo)致病原菌抗性增強(qiáng)和污染殘留嚴(yán)重，且破壞土壤微生態(tài)，導(dǎo)致煙葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響煙葉安全性；生物防治持效期較短且成本過(guò)高，且至今尚未尋找到完全抗TBS的煙草品種[5]。因此，亟需開(kāi)發(fā)防治TBS的有效、生態(tài)和綠色的措施。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的一種苯丙素類物質(zhì)，廣泛存在于自然界中。因其具有抗氧化、抗菌和清除自由基等多種生物活性，且安全、天然、造價(jià)低，日益成為食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。大量研究表明，CGA具有廣譜抗真菌和細(xì)菌活性[6-9]，且在增強(qiáng)植物抗病性方面發(fā)揮著重要的作用[10-11]。目前，有關(guān)CGA在煙草疫霉抑菌及TBS防治方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本文以離體培養(yǎng)的方式研究CGA對(duì)煙草疫霉的抑制作用，采用葉面噴施CGA來(lái)研究其對(duì)TBS的防治效果，為開(kāi)發(fā)新型植物殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用煙草疫霉為實(shí)驗(yàn)室保存菌種，用燕麥瓊脂培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱OA培養(yǎng)基）在26℃下培養(yǎng)1周左右后于4℃冰箱保存待用。供試煙草品種為K326。純品 CGA購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。試驗(yàn)于2020年12月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)品質(zhì)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 OA培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基的制備 將30g燕麥加純水煮爛（煮沸25min左右，燕麥微微膨脹裂開(kāi)），用 4層紗布過(guò)濾于燒杯中，用去離子水補(bǔ)充至1000mL，加入準(zhǔn)確稱量的15g瓊脂，攪拌完全后，分裝于三角瓶中，在121℃、0.1MPa條件下滅菌25min。冷卻至60℃后，取15mL滅菌培養(yǎng)基分別加入50和100μg/mL CGA，分別記為CGA1和CGA2，用磁力攪拌器混勻后，倒入培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫備用。以不添加CGA為對(duì)照（CK）處理。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定 用打孔器在培養(yǎng) 5～7d的OA培養(yǎng)基的等直徑菌落邊緣（菌絲長(zhǎng)勢(shì)一致）打取直徑為5mm的圓形疫霉菌餅，后用無(wú)菌接種針挑至平板中間，用封口膜密封好，試驗(yàn)中所用器具均為無(wú)菌器具，試驗(yàn)全程在超凈臺(tái)酒精燈火焰旁進(jìn)行。將接種好的平板置于26℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。待對(duì)照組平板長(zhǎng)滿菌絲后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌率（%）=（對(duì)照組菌落直徑?試驗(yàn)組菌落直徑）/對(duì)照組直徑×100。

1.2.3 掃描電鏡樣品的制備 選用培養(yǎng)6～7d的培養(yǎng)基，取培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的菌落，切下厚約20mm、長(zhǎng)約50mm的正方形菌塊，觀察面盡可能保持平整，用雙面膠粘在掃描電鏡樣品臺(tái)上，抽真空后，將樣品置于掃描電鏡（日立SU3500）上進(jìn)行觀察。

1.2.4 菌絲 PI染色 用無(wú)菌刮刀在長(zhǎng)勢(shì)均勻的對(duì)照平板和試驗(yàn)平板（100μg/mL）中分別刮取適量菌絲，在10%的福爾馬林溶液中浸泡固定1h后用PBS緩沖液反復(fù)沖洗數(shù)次，滴加 20μg/mL的 PI染液200mL，置于暗處30min，將帶有菌落的滴液置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 離體煙葉侵染試驗(yàn) 取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗自下而上第2片真葉進(jìn)行離體侵染。用無(wú)菌刀避開(kāi)葉脈十字劃傷葉片，接種5mm的圓形菌餅進(jìn)行侵染，覆蓋浸濕無(wú)菌水的脫脂棉并用保鮮膜保濕。將侵染后的離體煙葉置于均勻鋪滿脫脂棉和紗布的培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)盒上方覆保鮮膜保濕。對(duì)照組每天噴施3次無(wú)菌水，試驗(yàn)組每天噴施3次100μg/mL CGA溶液，共噴施3d，每組處理包含6片煙葉。

1.2.6 離體煙葉臺(tái)盼藍(lán)染色 將侵染3d后的離體煙葉用臺(tái)盼藍(lán)溶液在常溫下染色40min，之后用75%乙醇進(jìn)行脫色，每2～3h更換1次脫色液，直至葉片脫去綠色。

1.2.7 煙株侵染試驗(yàn) 待煙苗在基質(zhì)中長(zhǎng)至4～5片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行處理。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3株煙苗。

在煙株真葉上用無(wú)菌刀避開(kāi)葉脈十字劃傷葉片，打取5mm的圓形菌餅，用脫脂棉浸濕無(wú)菌水覆于菌餅上，再用保鮮膜覆蓋脫脂棉，完成接種。對(duì)照組每天揭開(kāi)脫脂棉噴施純水3次，試驗(yàn)組每天噴施100μg/mL CGA溶液3次，共噴施5d。

1.2.8 煙株生理特征 稱取0.5g 1.2.7中處理的煙葉樣品，加入5mL pH為7.8的磷酸緩沖溶液進(jìn)行冰浴研磨，低溫離心20min，取上清液（酶液）于4℃冰箱保存，用于測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性[12]。

POD活性：反應(yīng)液為0.1mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液50mL，置于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28μL，磁力攪拌器加熱攪拌至完全溶解，冷卻后加入30%過(guò)氧化氫（H2O2）19μL混合。酶液20μL，加入反應(yīng)液5mL于比色皿中，470nm下每隔1min讀數(shù)一次，共讀3次，以每分鐘吸光度變化值表示酶活力大小。

SOD活性：取同樣型號(hào)試管，吸取酶液20μL，加入反應(yīng)液3mL，4000lx照光30min，取2支對(duì)照空白試管以緩沖液代替酶液，空白置于暗處，對(duì)照和酶液同置于4000lx條件下照光30min，再遮光保存，以空白調(diào)零，測(cè)560nm處吸光值。

CAT活性：反應(yīng)液體系包含0.1mol/L H2O25mL和0.1mol/L、pH 7.0的緩沖液20mL。取0.1mL酶液加入到2.5mL反應(yīng)液中，測(cè)240nm處吸光值。

采用ELISA試劑盒測(cè)定多酚氧化酶（PPO）活性；采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）比色法測(cè)定煙葉中的可溶性蛋白含量；采用蒽酮法測(cè)定煙葉中可溶性糖含量；采用茚三酮法測(cè)定游離脯氨酸含量[13]。

可溶性蛋白含量：0.1g G-250反應(yīng)液溶于90%乙醇50mL中，加入85%磷酸100mL，定容至1000mL，過(guò)濾至棕色瓶中。取上述酶液20μL和反應(yīng)液3mL于常溫自然光放置2min，測(cè)595nm處吸光值。

可溶性糖含量：取0.5g煙葉，剪碎后置于研缽中，加蒸餾水1mL，研磨成勻漿，分2次各加蒸餾水2mL洗滌研缽，置于沸水浴中加蓋煮沸10min，冷卻后過(guò)濾，濾液收集到50mL容量瓶中，蒸餾水定容后，即為提取液。用移液管吸取提取液1mL和蒽酮0.5mL于25mL的大試管中，再加入濃硫酸5mL，輕輕搖勻，置于沸水浴10min。冷卻至室溫后于620nm下比色。

脯氨酸含量：取煙葉0.5g加3%磺基水楊酸5mL，沸水浴提取10min，冷卻至室溫，即為提取液。提取液2mL加入到含有2mL酸性茚三酮和2mL冰乙醇的試管中，沸水浴40min，溶液呈現(xiàn)紅色，冷卻后加甲苯5mL，搖勻后靜置10min，取上清滴至10mL離心管中，3000轉(zhuǎn)/min下離心5min。用吸管吸取上層紅色甲苯溶液于比色皿中，以甲苯為空白對(duì)照，520nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20中Duncan多重比較進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）（P＜0.05），采用 Excel進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CGA對(duì)煙草疫霉菌徑向生長(zhǎng)的抑制

由表1和圖1可知，CGA顯著抑制煙草疫霉的生長(zhǎng)，同時(shí)抑制作用隨CGA濃度的增加而增強(qiáng)，且各處理間差異顯著。CGA1處理下煙草疫霉菌徑向生長(zhǎng)已經(jīng)受到了顯著的抑制，抑菌率為 8.2%。CGA2處理下，菌落直徑從CK處理的7.51cm減小到5.95cm，抑菌率高達(dá)20.8%。

表1 不同濃度CGA對(duì)煙草疫霉菌徑向生長(zhǎng)的抑制Table 1 Effects of different concentrations of CGA on radial growth of P. nicotianae

圖1 不同濃度CGA對(duì)煙草疫霉菌徑向生長(zhǎng)的抑制Fig.1 Effects of different concentrations of CGA on radial growth of P. nicotianae

2.2 CGA2處理后煙草疫霉菌絲的形態(tài)變化

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，為了明確CGA對(duì)煙草疫霉的抑制作用，選擇100μg/mL的CGA與CK進(jìn)行菌絲形態(tài)對(duì)比分析。由圖2可知，與CK處理相比，CGA2處理的煙草疫霉菌菌絲發(fā)生了明顯的形態(tài)變化。CK處理的菌絲密集且完整，生長(zhǎng)十分規(guī)則，CGA2處理的菌絲量明顯減少，排列無(wú)序雜亂，菌絲有多處斷裂，部分菌絲異常生長(zhǎng)，產(chǎn)生小的結(jié)節(jié)。

圖2 CGA2處理對(duì)煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effects of CGA2 treatment on morphology of P. nicotianae

2.3 CGA2處理后煙草疫霉菌絲PI染色結(jié)果

熒光染料PI是一種細(xì)胞核染色劑，能對(duì)DNA進(jìn)行染色。鮮活的細(xì)胞膜能夠阻止PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而避免對(duì)DNA染色。破損的細(xì)胞膜則無(wú)法阻止其與胞內(nèi)DNA的特異結(jié)合，形成紅色熒光。如圖3所示，在普通光場(chǎng)下，CK處理的煙草疫霉菌絲形態(tài)飽滿圓潤(rùn)，表面較為光滑，菌絲量大且較為完整，CGA2處理后的煙草疫霉菌絲變得細(xì)小干癟，有多處斷裂。在熒光光場(chǎng)下，CK處理的菌絲視野內(nèi)僅有少量輕微泛紅，而CGA2處理后的菌絲視野內(nèi)幾乎整體變紅，證明經(jīng)CGA2處理后，煙草疫霉菌菌絲胞膜破裂嚴(yán)重，導(dǎo)致PI染料大量與胞內(nèi)DNA進(jìn)行特異結(jié)合，使視野內(nèi)呈現(xiàn)出大量紅色熒光。

圖3 CGA2處理對(duì)煙草疫霉菌絲細(xì)胞的影響Fig.3 Effects of CGA2 treatment on cell of P. nicotianae

2.4 離體煙葉侵染結(jié)果

如圖4所示，侵染3d后，CK處理的煙葉染病嚴(yán)重，病斑蔓延至主脈，并通過(guò)主脈擴(kuò)散至支脈，而CGA2處理的煙葉侵染面積顯著小于CK處理的煙葉，在侵染相同時(shí)間后，病斑尚未蔓延至主脈。

圖4 離體煙葉侵染結(jié)果Fig.4 Infection results of isolated tobacco leaves

臺(tái)盼藍(lán)是一種用于標(biāo)記死細(xì)胞的染料，可用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性，活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色[14]。圖5中經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后的CK處理呈現(xiàn)出面積較大的深藍(lán)色，而CGA2處理的煙葉則僅有小面積被染色，證明噴施CGA后煙葉細(xì)胞膜完整性較好，細(xì)胞死亡較少，CGA對(duì)感染疫霉菌的離體煙葉有較好的保護(hù)作用。

圖5 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果Fig.5 The results of trypan blue staining

2.5 煙株侵染結(jié)果

如圖6所示，CK處理的煙葉已經(jīng)發(fā)黃萎蔫，接種的葉片全部感染TBS，且感染面積大，感染程度深，而CGA2處理的煙葉僅接種處小面積感染，葉片未發(fā)生萎蔫。CGA2處理后，病斑平均面積由4.6個(gè)單位下降到1.2個(gè)單位，下降7%（圖7）。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，CGA2處理后病斑大小與CK處理差異顯著。表明葉片噴施CGA可顯著抑制病原真菌的擴(kuò)散，能有效緩解TBS對(duì)煙苗造成的損傷。

圖6 煙株侵染結(jié)果Fig.6 The results of P. nicotianae infection

圖7 噴施CGA對(duì)煙葉病斑大小的影響Fig.7 Effects of CGA foliar application on the lesion size in tobacco leaves

2.6 CGA對(duì)接種疫霉菌后煙草抗性相關(guān)酶活力的影響

如圖8所示，CGA2和CK處理抗性相關(guān)酶活性都有顯著差異。其中，CGA2處理的POD活性顯著高于CK處理，較CK處理升高72.6%（圖8a）；CGA2處理的SOD活性顯著上升54.6%（圖8b）；CGA2處理的CAT活性上升最多，達(dá)到155.8%（圖8c）；CGA2處理的 PPO活性也顯著上升了 8.2%（圖8d）。由此證明，CGA能夠顯著提高侵染后煙草幼苗中的POD、SOD、CAT和PPO等相關(guān)抗性酶活性，從而提高煙苗抵御疫霉菌侵害的能力。

圖8 CGA對(duì)接種疫霉菌后煙草葉片酶活力的影響Fig.8 Effects of CGA on the enzymes activities in tobacco leaves inoculated with P. nicotianae

2.7 CGA對(duì)接種疫霉菌后煙草中可溶性蛋白、可溶性糖以及脯氨酸含量的影響

由圖9可知，在CGA的影響下，煙草幼苗中的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量也表現(xiàn)出了顯著的差異。圖9a中，CGA2處理的可溶性蛋白含量由CK處理的3.0mg/g上升到5.3mg/g，顯著上升76.4%。CGA2處理可溶性糖和脯氨酸含量則有不同程度的下降，可溶性糖含量由CK處理的2.7mg/g降到1.5mg/g，顯著下降42.9%（圖9b）；脯氨酸含量也從CK處理的192.7μg/g下降到150.4μg/g，顯著降低22.0%（圖9c）。

圖9 CGA對(duì)接種疫霉菌后煙草可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.9 Effects of CGA on soluble sugar, soluble protein and proline contents in tobacco leaves inoculated with P. nicotianae

3 討論

CGA是一種天然、安全的酚類物質(zhì)，具有良好的抑菌活性。本研究表明，離體條件下 100μg/mL CGA可顯著抑制煙草疫霉的生長(zhǎng)，菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)干癟，部分菌絲發(fā)生斷裂，大量細(xì)胞死亡，這與陳娟妮等[15]關(guān)于納米氧化鋅對(duì)煙草疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用研究結(jié)果基本一致。

在抑菌活性的研究基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步確定 CGA對(duì)TBS的防治效果，采用抑菌效果更好的100μg/mL CGA溶液噴施葉片，結(jié)果表明，無(wú)論是離體葉片還是活體植株，噴施CGA均可顯著降低葉片的病斑大小。

植物在遭受病原菌侵染后，往往伴隨著活性氧的爆發(fā)，造成植株的氧化損傷[16]。抗氧化酶POD、SOD和CAT等主要用于清除有機(jī)體內(nèi)過(guò)多的活性氧，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度。本研究中，外源CGA的施用顯著提高了煙葉中POD、SOD和CAT的活性，將有助于減少煙葉內(nèi)由煙草疫霉侵染帶來(lái)的活性氧累積，保護(hù)葉片免受氧化損傷，這與開(kāi)凱[17]在CGA對(duì)獼猴桃和櫻桃番茄采后病原菌抑制作用研究中POD、SOD和CAT活性變化基本一致。PPO是參與植物抗病代謝的關(guān)鍵酶，其活性可直接反映植物的抗病能力[18]。施用外源 CGA后，煙葉PPO活性顯著提高，表明煙葉的抗病性有所提高，這與張鈺等[19]研究中PPO活性增加有助于增強(qiáng)楊樹(shù)抗?jié)儾∧芰Φ慕Y(jié)論一致。

可溶性蛋白是了解植物總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，CGA處理后的煙葉可溶性蛋白含量增加，很可能是出現(xiàn)了新的病程相關(guān)蛋白[20]。糖分在植物防御反應(yīng)中占據(jù)著重要地位。本研究表明，CGA2處理后病煙葉中可溶性糖含量顯著降低，推測(cè)植物體內(nèi)低糖含量有利于植物抗病。與此類似，趙芳等[21]的研究也表明可溶性糖含量與煙草赤星病的病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。

脯氨酸是植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧以維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，較高的脯氨酸含量有利于提高植物的抗逆性[22]。本研究中CGA2處理的煙葉脯氨酸含量反而降低，這可能是由于噴施CGA，嚴(yán)重阻礙了煙草疫霉的侵染，使得煙株本身不需要產(chǎn)生更多的脯氨酸抵御煙草疫霉的入侵。

4 結(jié)論

CGA能顯著抑制煙草疫霉的生長(zhǎng)，且隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。噴施100μg/mL CGA溶液可顯著降低煙葉病斑大小，明顯提高抗氧化酶及抗病相關(guān)酶活，且影響煙葉細(xì)胞的內(nèi)含物含量。由此可見(jiàn)，CGA不僅能夠直接抑制煙草疫霉的生長(zhǎng)，也有助于提高煙草抵抗TBS的能力，有較大潛力發(fā)展成為防治TBS的安全殺菌劑。