微波輔助提取崀山臍橙皮總黃酮及生物活性研究

周新崇，易燦，劉進(jìn)兵

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000)

邵陽(yáng)市新寧縣崀山片區(qū)是湖南省臍橙的重要產(chǎn)區(qū)。自20世紀(jì)70年代大力推廣種植臍橙以來(lái)[1]，已經(jīng)成為全國(guó)較大的臍橙生產(chǎn)區(qū)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)[2]。臍橙皮中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)[3]，具有抗氧化、抗炎癥、降血壓、抗突變等作用[4]。目前，橘皮黃酮提取的主要方法有微波提取[5-6]、超聲提取[7-8]、微切輔助提取[9]。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)崀山臍橙皮總黃酮的微波提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

崀山臍橙皮粉 (采摘自湖南省邵陽(yáng)市新寧縣白沙鎮(zhèn)白沙園藝場(chǎng)12月成熟期的崀山臍橙果，取其果皮在 60℃ 恒溫干燥至恒重，粉碎過(guò)孔徑為0.25 mm的篩)；蘆丁對(duì)照品(純度98%)(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；Al(NO3)3(分析純) 和 NaNO3(分析純) (天津博迪化工有限公司)；氫氧化鈉(分析純)(天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng))；無(wú)水乙醇(分析純)(重慶萬(wàn)盛川東化工有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1AB烘箱(天津市泰斯儀器有限公司)；SF-130型高速中藥粉碎機(jī)(中南制藥機(jī)械廠(chǎng))；ME203E型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器、SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵(鞏義市中天儀器科技有限公司)；SB-5200DT 超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制參考文獻(xiàn)[10-11]。精密稱(chēng)取干燥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，燒杯溶解后置于50 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù) 70% 乙醇溶液定容，搖勻，既得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫避光保存。再?gòu)钠渲袦?zhǔn)確分別吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL置于10 mL比色管中；滴加0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置3 min；再滴加0.30 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min充分反應(yīng)；最后滴加2.00 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至10 mL，靜置15 min；用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定在510 nm下的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL) 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2 崀山臍橙皮總黃酮提取及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取崀山臍橙皮粉0.50 g，放入三口燒瓶中，加入一定體積、一定濃度的乙醇溶液，放入微波化學(xué)反應(yīng)器中，在一定的功率和溫度條件下，微波提取一定時(shí)間，抽濾，用體積分?jǐn)?shù) 70%的乙醇溶液洗滌濾渣3次，取濾液定容到50 mL容量瓶中。用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL待測(cè)液于10 mL比色管中，按照2.1節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制方法測(cè)定在510 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A),按照公式(1)計(jì)算崀山臍橙皮中黃酮提取量Y(mg/ g)[10]:

(1)

2.3 單因素試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[6]。稱(chēng)取崀山臍橙皮粉 0.50 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù) 70% 、料液比1∶20 g/mL、溫度 60 ℃、微波功率為 480 W 的條件下，提取時(shí)間為4 min，分別考察提取次數(shù)(1，2，3，4和5次)的影響，時(shí)間間隔為10 min，通過(guò)計(jì)算黃酮提取量，選擇合適的提取次數(shù)。

再分別考察提取時(shí)間(2，3，4，5和6 min)；提取溫度(40，50，60，70和80 ℃)；微波功率(320，400，480，560和640 W)；乙醇體積分?jǐn)?shù)(50% ，60%，70%，80%和90%)以及料液比(1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL)對(duì)黃酮提取量的影響。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案

參照陳源等[12-13]的方法。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)為影響因素，以黃酮的提取量作為響應(yīng)值，利用 Design Expert 12.0 軟件，根據(jù) Box-Behnken 試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)方案，通過(guò)試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步得出微波輔助法提取崀山臍橙皮中總黃酮的最優(yōu)工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1。

表1 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

2.5 崀山臍橙皮黃酮抗氧化活性的測(cè)定

崀山臍橙皮中總黃酮提取物對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定和ABTS+·清除能力的測(cè)定參照田建華等[11,14]的方法進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及回歸方程

如圖1所示，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行擬合，得線(xiàn)性回歸方程：y=7.500 09x+0.004 040 93，R2=0.999 19。結(jié)果表明：在 0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 The standard curve of rutin

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2(a)可知：崀山臍橙皮中黃酮提取量隨著提取次數(shù)增多，先呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，在提取到第3次后增加緩慢?？紤]到時(shí)間和能源消耗，因此，微波提取的次數(shù)選擇為3次。由圖2(b)可知：黃酮提取量在2～4 min之間不斷增加，在4 min達(dá)到最大值，超過(guò)4 min后提取量不斷減少，可能是時(shí)間越長(zhǎng)，導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)發(fā)生氧化降解[15]，使其含量下降。由圖2(c)可知：改變提取溫度對(duì)崀山臍橙皮黃酮提取量的影響不顯著，在60 ℃ 時(shí)達(dá)到最大值。由圖2(d)可知：當(dāng)微波功率在480 W時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，超過(guò)480 W黃酮提取量不斷減少，可能原因是微波功率增大，破壞了黃酮提取物有效成分的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致含量降低。由圖2(e)可知：崀山臍橙皮黃酮提取量先隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大先增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為 70% 時(shí)達(dá)到最大值，隨后不斷減小?？赡苁且掖俭w積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，不能完全溶解黃酮類(lèi)物質(zhì)；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，醇溶性的色素[16]及親脂性強(qiáng)的成分溶出，在溶液中競(jìng)爭(zhēng)同乙醇-水分子結(jié)合，降低了黃酮活性成分與乙醇-水分子的結(jié)合，降低了黃酮提取量。由圖2(f)可知：崀山臍橙皮黃酮提取量隨著料液比增大而增加，料液比在 1∶40 g/mL 時(shí)達(dá)到最大值。可能是隨著料液比增大，溶劑的用量增加到一定程度后，黃酮活性成分基本溶出[17]，繼續(xù)增大料液比會(huì)使非黃酮類(lèi)其他醇溶性雜質(zhì)析出，與活性成分共同競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致含量下降[18]。

圖2 崀山臍橙皮黃酮提取量的單因素實(shí)驗(yàn)Fig.2 Single factor experiment on extraction of flavonoids from Langshan navel orange peel

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及方差分析

3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與方差顯著性分析

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken 響應(yīng)面試驗(yàn)原理，選取了提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)對(duì)提取量變化大的影響因素，以崀山臍橙皮總黃酮提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

用 Design Expert 12.0 軟件，對(duì)表 2 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到表 3 的回歸方程方差分析表；利用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，獲得崀山臍橙皮黃酮提取量對(duì)提取時(shí)間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)的二次多元回歸預(yù)測(cè)模型為：黃酮提取量Y= 2.93+0.081 7A+0.107 5B+0.280 0C-0.072 5D-0.160 0AB-0.015 0AC+0.005 0AD-0.070 0BC+0.152 5BD+0.105 0CD-0.251 2A2-0.220 0B2-0.243 8C2-0.197 5D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知：對(duì)該模型進(jìn)行顯著性分析，F(xiàn)回歸值=25.69，P<0.000 1，說(shuō)明該回歸模型顯著，即各因素提取時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比與黃酮提取量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著，試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽?；F失擬值=1.28，P=0.4362>0.05，說(shuō)明失擬不顯著，該試驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性，試驗(yàn)誤差較小，該模型對(duì)試驗(yàn)擬合較好[11]。能夠用來(lái)分析和預(yù)測(cè)微波輔助提取崀山臍橙皮總黃酮的最優(yōu)工藝條件。

根據(jù)表 3 的P值可知:C,A2,B2,C2,D2的偏回歸系數(shù)差異極度顯著，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮的提取量有極度顯著的影響。A,B,D,AB,BD的偏回歸系數(shù)差異高度顯著，說(shuō)明提取時(shí)間、微波功率、料液比對(duì)黃酮提取量有高度顯著的影響，CD的偏回歸系數(shù)差異顯著，說(shuō)明因素之間有交互影響，對(duì)響應(yīng)值有非簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analyses of variance for the fitted regression model

根據(jù)表3的F值可知:單因素對(duì)崀山臍橙皮黃酮提取量的影響主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間和料液比。

3.3.2 響應(yīng)面各因素間的交互作用分析

提取時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比交互作用對(duì)崀山臍橙黃酮提取量的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖3，由圖3(a)、3(f)可以看出：等高線(xiàn)呈橢圓形，且從表3中看出：AB，BD的P值為差異高度顯著，說(shuō)明提取時(shí)間與微波功率、微波功率與料液比之間的交互作用對(duì)黃酮提取量的影響較大。圖3(e)可以看出：等高線(xiàn)呈微橢圓形，且表3中方差分析CD的P值差異顯著，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用對(duì)黃酮提取量的影響次之；其他的圖3(b)、圖3(c)、圖3(d)的等高線(xiàn)近圓形，坡度相對(duì)平緩，說(shuō)明提取時(shí)間與乙醇濃度、提取時(shí)間與料液比、微波功率與乙醇濃度間的交互作用對(duì)崀山臍橙皮中黃酮提取量的影響較小。

3.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化的驗(yàn)證

采用 Design Expert 12.0 軟件，分析得到崀山臍橙皮黃酮提取量的理論最佳值為3.02 mg/g，其對(duì)應(yīng)的最佳提取工藝條件如下：提取時(shí)間為4.11 min、微波功率為489.68 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 75.56 %、料液比為1∶40.13 g/mL；考慮到試驗(yàn)操作的可行性，將最佳條件調(diào)整如下：提取時(shí)間為4 min、微波功率為480 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%、料液比為1∶40 g/mL。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，得到崀山臍橙皮黃酮提取量分別為2.93，2.96和2.98 mg/g，平均值為2.96 mg/g，與理論值相對(duì)誤差為1.99%，說(shuō)明該工藝優(yōu)化得到的模型工藝參數(shù)是可靠穩(wěn)定的。與王曉君等[6]的微波輔助復(fù)合酶法提取對(duì)比，酶的參與能進(jìn)一步提高臍橙皮提取的黃酮含量。

3.4 崀山臍橙皮總黃酮提取物的抗氧化活性

崀山臍橙皮總黃酮提取物的DPPH·清除能力見(jiàn)圖4(a)。在 0～200 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增加，對(duì) DPPH·的清除能力快速增加。與陽(yáng)性對(duì)照VC相比活性稍差，VC的IC50為34.253 mg/L ，提取物黃酮IC50為133.856 mg/L。崀山臍橙皮總黃酮提取物對(duì)ABTS+·清除能力的測(cè)定見(jiàn)圖4(b),清除能力和陽(yáng)性對(duì)照VC相當(dāng)，VC的IC50為41.384 mg/L，崀山臍橙皮總黃酮提取物IC50為44.077 mg/L。

圖4 崀山臍橙皮總黃酮提取物的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of total flavonoids extract from Langshan navel orange peel

4 結(jié)論

本研究對(duì)微波法提取崀山臍橙皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化其工藝條件，確定了微波提取崀山臍橙皮總黃酮的最優(yōu)工藝條件如下：提取時(shí)間為4 min、微波功率為480 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%、料液比為1∶40 g/mL，在此條件下驗(yàn)證試驗(yàn)得到的黃酮提取量為2.96 mg/g，提取工藝條件條件溫和、方法簡(jiǎn)單，具有一定的抗氧化活性。