3D生物打印及其在組織工程中的應(yīng)用

李紅，吳佳成，郭闖

(1.暨南大學(xué) 化學(xué)與材料學(xué)院，廣東 廣州，511436 ；2.人工器官及材料教育部工程研究中心，廣東 廣州，510632)

3D打印又稱增材制造技術(shù)，它基于分層制造的原理來實(shí)現(xiàn)材料的加工。在計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)模型或計(jì)算機(jī)控制下,通過斷層掃描，準(zhǔn)確控制材料的成型[1],這種技術(shù)可快速制造復(fù)雜形狀的組件。廣義上講，直接與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)的3D打印可視為3D生物打印，分為5個(gè)不同技術(shù)層次[2]，見圖1。狹義上講，3D生物打印一般是指與細(xì)胞混合后的3D打印[3]，或者打印后的材料用于細(xì)胞的生長以構(gòu)建組織或者器官，即圖1中的第三、四和五階段。本文主要介紹的是第三階段，即3D生物打印制造組織工程支架并應(yīng)用于組織修復(fù)中的研究進(jìn)展。

圖1 生物三維打印發(fā)展的不同技術(shù)階段Fig.1 Development stage of biological 3D bioprinting

組織損傷是常見病和多發(fā)病。為了修復(fù)受損的組織和器官以恢復(fù)它們的功能，20世紀(jì)90年代提出了組織工程這一理念[4]。組織工程是將種子細(xì)胞接種于三維組織工程支架，同時(shí)，添加一些生長因子或者藥物，以修復(fù)受損組織的技術(shù)[5]。從設(shè)計(jì)上，它是先在體外構(gòu)建器官或者組織，然后通過植入體內(nèi)替換或者修復(fù)受損組織[6]。目前，組織工程是最有前景的人體組織修復(fù)或再生方法。

支架是組織工程三大要素之一，用以支撐細(xì)胞的生長和增殖。早期的組織工程支架在結(jié)構(gòu)上一般是多孔的[7]，無法模擬人體組織復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，故細(xì)胞難以長入支架內(nèi)部，導(dǎo)致修復(fù)失敗或者不足。3D打印技術(shù)克服了早期組織工程支架加工的局限性，賦予了支架良好的孔隙率，增大了細(xì)胞與材料的接觸面積，解決了細(xì)胞只能黏附于支架表面的問題，便于細(xì)胞黏附生長[8]。迄今為止，3D生物打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高度復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)的制造，從而改變了組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的修復(fù)理念和方法[9]。

1 3D生物打印方法

迄今為止，已經(jīng)出現(xiàn)了許多3D打印技術(shù)，例如熔融打印、擠出打印、噴墨打印、光固化打印和激光輔助打印等。下面簡單介紹用于組織工程領(lǐng)域的3D生物打印技術(shù)。

1.1 熔融打印

熔融打印是一種將材料(通常是熱塑性聚合物)在噴嘴處加熱到半液態(tài)，然后噴射到基板上，在室溫下暴露在空氣中發(fā)生凝固，從而形成三維結(jié)構(gòu)的打印方法[10]。它是通過噴嘴來控制X-Y軸方向和通過打印平臺來控制Z軸方向的移動(dòng)，精確制造想要的結(jié)構(gòu)。打印過程高度依賴材料的熱塑性，常用的材料有聚乳酸和聚碳酸酯等，也可以將多種材料復(fù)合進(jìn)行打印。支架打印完成后，對支架的表面進(jìn)行改性或者負(fù)載藥物，然后接種細(xì)胞，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)可用于組織修復(fù)[10]。

1.2 擠出打印

擠出打印是通過控制活塞、氣動(dòng)泵或螺釘?shù)臄D壓使水凝膠通過噴嘴擠出到基板上的打印方法[11]。它的打印原理和熔融打印比較接近，但是擠出打印一般用于打印流體材料，例如生物墨水。擠出打印使用的生物墨水必須具有足夠的黏度和交聯(lián)能力，以便在打印的過程中和打印后保持良好結(jié)構(gòu)。然而擠出打印的精度一般不高，為了克服這一缺點(diǎn)，研究人員開發(fā)了一些新技術(shù)，例如懸浮水凝膠的自由形式可逆嵌入(FRESH)技術(shù)[12]和低溫?cái)D出技術(shù)[13]。

1.3 噴墨打印

噴墨打印的機(jī)制和打印機(jī)的機(jī)理相同：通過熱刺激、壓電刺激或電磁刺激在噴嘴中產(chǎn)生氣泡，由于氣泡的形成和破裂產(chǎn)生的壓力，打印材料以水滴的形式從噴嘴中噴射出來[14]。一般都是用熱噴墨技術(shù)來打印含細(xì)胞的生物材料，因?yàn)閴弘姶碳ず碗姶糯碳?xì)胞有害，而熱刺激一般的溫度變化在4～10 ℃之間，且時(shí)間非常短，通常在2 μs左右。這種溫度變化對細(xì)胞幾乎無影響，甚至可能激活細(xì)胞促進(jìn)血管的生成[15]。噴墨打印具有很高的分辨率，最高可以達(dá)到30 μm。噴墨打印對于材料的要求高，首先，噴墨墨水的黏度要求非常低，以確保它們能夠正常沉積，同時(shí)，可以將細(xì)胞離開噴嘴時(shí)所受到的剪切力降到最低，通常來說，墨水的標(biāo)準(zhǔn)黏度應(yīng)該小于100 mPa·s，剪切應(yīng)力應(yīng)保持在10 kPa以下以避免細(xì)胞活力顯著下降[16]。但成型后墨水必須能夠經(jīng)過某種形式的二次交聯(lián)且交聯(lián)后具有一定的機(jī)械性能，以便打印結(jié)構(gòu)可以在Z軸方向上不斷地構(gòu)建[16]。

1.4 光固化打印

光固化成型是最早的3D打印成型技術(shù)，也是目前較為成熟的3D打印技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是利用材料的疊加成型，將一個(gè)立體的目標(biāo)零件的形狀分為若干個(gè)平面層，以一定波長的光束掃描液態(tài)光敏樹脂，使每層液態(tài)光敏樹脂被掃描到的部分固化成型，而未被光束照射的地方仍為液態(tài)，最終，各個(gè)層面累積成所需的三維支架[5]。光固化打印的打印速度極快而且能夠打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但是它需要光線照射，并且材料的選擇也受到限制，同時(shí)光固化打印的墨水還需要具有光敏性和剪切變稀的能力。光固化打印又可以分為立體光刻(stereo lithography，SLA)技術(shù)[5]和數(shù)字光處理(digital light processing，DLP)技術(shù)[17]，這兩種技術(shù)的原理是相似的，都是通過紫外光或可見光照射光敏樹脂固化成型。

1.5 激光輔助打印

激光輔助打印是將生物墨水以薄片或者薄膜的形式附在一層能量吸收材料(通常是金或者鈦)上，然后從材料上方，發(fā)射激光在2層產(chǎn)生脈沖，引起相位變化，將細(xì)胞墨水噴射到下面的接收平臺[18]。激光輔助打印最初用于金屬制造，在組織修復(fù)中已被用于器官和組織的制造[1]。激光輔助生物打印具有較高的打印分辨率和細(xì)胞存活率，能夠打印高密度的細(xì)胞生物墨水，但其設(shè)備昂貴，且對材料的要求較高，故沒有被廣泛使用[11]。

2 3D生物打印在組織工程中的應(yīng)用

為了實(shí)現(xiàn)人體組織的體外構(gòu)建，基于組織工程的原理，使用3D生物打印技術(shù)制造出各種組織工程支架或類組織、類器官[19]。

2.1 在硬組織修復(fù)中的應(yīng)用

2.1.1 骨和軟骨

骨骼是一種由納米羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)和膠原蛋白組成的復(fù)雜組織，具有一定的自修復(fù)能力。骨組織工程支架的主要目標(biāo)是促進(jìn)骨骼修復(fù)，并且由于部分位置的骨在體內(nèi)起到承重的功能，所以，使用的材料需要擁有一定的機(jī)械性支撐能力，例如生物活性陶瓷[20]和生物活性聚合物等[21]。但更重要的是，要能有效促進(jìn)骨組織的修復(fù)和重建，所以支架常負(fù)載藥物或者其他活性成分。TARAFDER等[22]通過3D打印制備了多孔磷酸三鈣支架，其中使用了聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)負(fù)載阿侖膦酸鹽涂附在支架的表面。阿侖膦酸鹽是一種用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。體外和體內(nèi)的結(jié)果表明：該支架中負(fù)載的阿侖膦酸鹽具有持續(xù)和受控釋放能力，并且該支架可增加細(xì)胞活性并誘導(dǎo)骨形成。

CAETANO等[23]使用熔融螺桿擠出3D打印制造了PCL/石墨烯支架，其支架中的石墨烯納米片均勻分布，支架上涂有乳膠蛋白。隨后將人類的脂肪干細(xì)胞(human adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSC)接種在支架上。結(jié)果表明:含有蛋白質(zhì)和石墨烯的支架可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成骨分化，從而實(shí)現(xiàn)骨骼重建。

血管化一直是骨修復(fù)的難點(diǎn)。KUSS等[24]將ADMSC和人類的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)包裹在透明質(zhì)酸和明膠的生物活性水凝膠中進(jìn)行共培養(yǎng)，然后將打印好的PCL/HAP支架浸泡在水凝膠中，最后，通過紫外照射進(jìn)行光聚合，形成一個(gè)復(fù)合三維組織工程支架， 見圖2。該復(fù)合支架能有效促進(jìn)血管生成、細(xì)胞生長和遷移，在支架中形成了毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有望用于較大骨缺損的修復(fù)。

圖2 將打印的支架與充滿細(xì)胞的水凝膠結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。 圖片轉(zhuǎn)載已經(jīng)許可(5222220310899)[24]Fig.2 The schematic diagram of experimental design，combine the printed scaffold with a cell-filled hydrogel Image reproduced with permission from(5222220310899)[24]

高精度支架和高細(xì)胞活力是目前3D生物打印的一大挑戰(zhàn)，IDASZEK等[25]制作了一種由海藻酸鹽+甲基丙烯?；髂z+含硫酸軟骨素的丙烯酸乙酯組成的水凝膠，再加入甲基丙烯?；男缘耐该髻|(zhì)酸、磷酸三鈣及干細(xì)胞和復(fù)合光引發(fā)劑，構(gòu)成模擬鈣化軟骨的生物墨水。通過使用微流體打印結(jié)合擠出生物打印，甲基丙烯酰胺化的明膠和透明質(zhì)酸的快速光固化，保證了打印精度。而硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸和磷酸鈣在成分上模擬了鈣化軟骨的組成。結(jié)果表明：該打印系統(tǒng)可以制造精度約為100 μm的仿生組織，并且細(xì)胞活力超過90%，在制造肌腱和軟骨組織等方向具有應(yīng)用前景。

雖然3D打印可以個(gè)性化地定制適合骨缺損部位的支架[19]，但目前的骨組織工程支架無法滿足機(jī)械性能和生物相容性的要求。因此，對高強(qiáng)度墨水的制造是目前研究的熱點(diǎn)，比如引入活性位點(diǎn)促進(jìn)交聯(lián)[26]、引入其他高模量的組分[27]等。

2.1.2 牙體及牙周組織

牙齒是人身體中最堅(jiān)硬的組織之一[28]，牙體損傷與骨組織不同，損傷后難以自身修復(fù)。使用包含細(xì)胞、三維支架和生長因子的牙組織工程是目前較有前景的修復(fù)方法之一[29]。由于牙齒的組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，特別是在牙周組織部位，目前3D生物打印支架在牙科方面有一定的局限性。

LEE等[30]采用3D打印技術(shù)構(gòu)建PCL/HAP支架，將人牙釉蛋白、結(jié)締組織生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白包裹在聚乳酸-羥基乙酸聚合物中，并轉(zhuǎn)移到已構(gòu)建好的支架中形成一個(gè)三相支架。該研究通過設(shè)計(jì)不同孔徑的孔洞來模仿牙本質(zhì)、牙周韌帶和牙槽骨等不同組織。在支架上接種牙髓祖細(xì)胞，皮下植入小鼠，形成了富含Ⅰ-膠原蛋白的組織，利于修復(fù)牙周組織。

PARK等[31]使用熔融3D打印技術(shù)成功制造了β-磷酸三鈣/PCL牙體組織工程支架。該支架表面隨著β-磷酸三鈣含量增加變得更加粗糙多孔，能夠有效促進(jìn)小鼠間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞生長和成骨分化，該支架有可能在體外構(gòu)建“假牙”。

KHAYAT等[32]將人牙髓干細(xì)胞和含有內(nèi)皮細(xì)胞的5%甲基丙烯酰化明膠注射到牙根段，該含有細(xì)胞的水凝膠促進(jìn)了組織新血管形成。然而，目前關(guān)于牙組織工程的研究僅僅檢查了血管神經(jīng)樣組織的形成，并沒有證實(shí)新生組織的完整性和功能性，很多組織工程支架在體內(nèi)植入后由于營養(yǎng)缺乏而壞死[33]。因此，通過3D生物打印建立完整的血液供應(yīng)系統(tǒng)對于維持再生組織中的營養(yǎng)交換至關(guān)重要[33]。

2.2 在軟組織修復(fù)中的應(yīng)用

2.2.1 皮膚

皮膚作為人體最大的器官，其特點(diǎn)是不同層細(xì)胞種類和組織結(jié)構(gòu)不同。LEE等[34]以角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原蛋白為材料，通過3D生物打印制造出多層結(jié)構(gòu)。在這項(xiàng)研究中，利用了3D打印逐層打印的優(yōu)勢，使用不同的材料或者細(xì)胞打印不同的層面。當(dāng)膠原蛋白層被打印出來時(shí)，一層成纖維細(xì)胞就被打印到上面，然后，再打印一層膠原蛋白層，重復(fù)上述的操作，最后，再打印角質(zhì)細(xì)胞層。這種3D打印的皮膚模型在培養(yǎng)時(shí)期能夠保持其整體的形狀和結(jié)構(gòu)，且保持了這2種細(xì)胞的細(xì)胞活性和增殖能力。

與擠出生物打印相比，光固化打印具有更高的打印速度和打印精度，并且由于沒有擠壓使細(xì)胞受力這一過程，所以，光固化打印的細(xì)胞存活率更高。PEREIRA等[35]開發(fā)了一種具有可控的機(jī)械特性和流變的單組分果膠基生物墨水，該生物墨水可以紫外光固化，再通過離子凝膠來調(diào)整其機(jī)械性能，或者也可以先通過離子凝膠來調(diào)節(jié)墨水的性能，提升打印精度，最后進(jìn)行光固化成型。該生物墨水可用于層層之間力學(xué)性能不同的3D皮膚結(jié)構(gòu)的生物打印，且作為細(xì)胞的載體，支持成纖維細(xì)胞的黏附和分化，在皮膚再生修復(fù)方向具有巨大的潛力。

然而，光固化中采用的紫外光可能會對細(xì)胞造成一些未知的不可逆的損傷。最近，WANG等[36]開發(fā)了一種具有良好生物相容性的基于Eosin Y(EY)的光引發(fā)技術(shù)，完美地解決了這一問題，其使用波長在500～600 nm。該生物打印系統(tǒng)可以輕松制備結(jié)構(gòu)復(fù)雜的載細(xì)胞水凝膠，水凝膠內(nèi)的細(xì)胞可以進(jìn)行增殖，形成三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。這種基于可見光的生物墨水的交聯(lián)時(shí)間大約為10 min，因而適合長時(shí)間的生物打印。

3D生物打印可以制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜并且由多種細(xì)胞組成的皮膚組織，并且植入皮膚表面之后可以重建原生組織的結(jié)構(gòu)與功能[37]，有助于皮膚傷口的修復(fù)。因此，3D打印皮膚被認(rèn)為是最快應(yīng)用于臨床的產(chǎn)品。

2.2.2 血管

目前各種3D生物打印技術(shù)中，主要有2種方法[38]用于打印人造血管：1)擠出打?。?)光固化打印。

ITOH等[39]使用3D生物打印機(jī)制造了由ADMSC組成且內(nèi)徑為1.5 mm的無支架管狀組織，然后，將這些組織放在灌注系統(tǒng)中培養(yǎng)，最后，通過超聲波評估了流量并進(jìn)行了組織學(xué)分析。結(jié)果表明：該管狀組織在植入老鼠腹主動(dòng)脈后的第2天和第5天，管道依舊通暢，并且在植入后第5天發(fā)現(xiàn)有一層內(nèi)皮細(xì)胞。

YU等[40]開發(fā)了一種新型的同軸噴嘴，外環(huán)通道擠出含細(xì)胞的海藻酸鹽溶液，內(nèi)環(huán)通道擠出氯化鈣溶液。當(dāng)2種溶液接觸時(shí)，立即發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生中空的海藻酸管狀結(jié)構(gòu)。支架與患者自身的內(nèi)皮細(xì)胞同時(shí)打印有助于產(chǎn)生功能性血管。管狀結(jié)構(gòu)具有可灌注性和滲透性，利于血流循環(huán)，促進(jìn)代謝和新組織的形成。

但同軸打印仍然存在不足，例如管子直徑主要取決于噴嘴的幾何形狀，因此制造支管時(shí)存在困難。LI等[41]首先打印了Y形結(jié)構(gòu)，然后，將最外層進(jìn)行凝膠化，在內(nèi)部未凝膠化的部分熔融后，整個(gè)結(jié)構(gòu)浸入CaCl2中進(jìn)行完全凝膠化，最后，剪除Y形底部以實(shí)現(xiàn)分支管狀結(jié)構(gòu)。

目前人造血管的3D打印仍有許多的問題需要解決，例如細(xì)胞和材料要求，異型血管形成[42]和功能化[43]等。

2.2.3 心臟

心臟是人體中重要的器官之一，是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，但是其本身在受到損傷時(shí)的修復(fù)能力十分有限。使用3D打印技術(shù)構(gòu)建心血管結(jié)構(gòu)，可以創(chuàng)建多孔結(jié)構(gòu)用于營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運(yùn)輸[44]。

GAETANI等[45]利用3D打印技術(shù)加工了一個(gè)由透明質(zhì)酸和明膠組成的心臟貼片。體外研究表明：細(xì)胞在支架上的增殖分化能力良好。將打印的貼片移植到心肌梗塞的小鼠模型中，4周后，其心臟和血管分化標(biāo)記物隨時(shí)間增加?？傮w而言，該貼片可以促進(jìn)心肌梗死后的心臟重構(gòu)。

為了減小人體內(nèi)免疫排斥反應(yīng)，通常會選用自體的細(xì)胞及脫細(xì)胞基質(zhì)材料進(jìn)行治療。NOOR等[46]從患者身上提取了一個(gè)網(wǎng)膜組織，并從組織中分離了細(xì)胞，并將脫細(xì)胞組織制備成水凝膠。分離出的組織細(xì)胞被重新編程為多功能干細(xì)胞，然后分化成心肌細(xì)胞(endothelial cells，EC)和內(nèi)皮細(xì)胞(cardoimyocytes，CM)，隨后與水凝膠混合，制備成生物墨水，最后通過3D生物打印，制造了帶血管的心臟貼片和人工心臟，制備工藝過程見圖3。該研究提供了一條打印與人體具有高度免疫學(xué)匹配的人工心臟的新型路徑。

圖3 3D打印人工心臟制備示意圖。 圖片轉(zhuǎn)載已經(jīng)許可[46]Fig.3 Conceptual schematic diagram of artificial heart via 3D bioprinting. Image reproduced with permission from[46]

眾所周知，使用軟蛋白和多糖水凝膠進(jìn)行復(fù)雜三維生物結(jié)構(gòu)的增材制造是難以實(shí)現(xiàn)的，但這兩種材料又是人體組織最主要的組成成分。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展， HINTON等[12]開發(fā)了一種新型的打印方式，也就是FRESH技術(shù)，基于此方法，成功使用膠原、海藻酸鈉等材料打印了冠狀動(dòng)脈和股骨等一系列復(fù)雜的組織模型。目前3D打印技術(shù)可以制造精細(xì)結(jié)構(gòu)模型，提供更好的解剖結(jié)構(gòu)，讓醫(yī)生進(jìn)行術(shù)前培訓(xùn)[47]，但是無法實(shí)現(xiàn)其功能化。為此， LEE等[48]開發(fā)了一個(gè)新的支撐水凝膠(FRESH v2.0)，以制造人工心臟。通過pH驅(qū)動(dòng)打印膠原蛋白凝膠，其分辨率可達(dá)20 μm。打印的人心肌細(xì)胞的心室顯示同步收縮，定向動(dòng)作電位傳播以及在收縮峰值期間壁增厚達(dá)14%。同時(shí)，該支撐浴可以大幅度提高細(xì)胞活力，促進(jìn)新血管的生成，并且以膠原蛋白為生物墨水打印支架足以保障其生物相容性。該方法現(xiàn)在已經(jīng)有能力重建原生組織的結(jié)構(gòu)、力學(xué)和部分生物學(xué)特性，為人工組織結(jié)構(gòu)制造開辟了新方向。

3 前景與挑戰(zhàn)

目前3D生物打印在組織工程中的應(yīng)用還有很多不足之處。從材料方面來說，可用于打印的材料較少，生物相容性、可控的降解速率和機(jī)械性能無法同時(shí)滿足要求。打印技術(shù)方面，目前已經(jīng)有將細(xì)胞與材料混合后進(jìn)行打印的方法，但對支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)交換等問題仍然缺乏好的解決方案。最后，人體中的組織成分多樣以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，3D打印技術(shù)尚無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的仿生構(gòu)造；并且，體外環(huán)境難以完全模擬細(xì)胞外基質(zhì)[2]。

3D生物打印將生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和工學(xué)緊密結(jié)合起來，為解決上述問題，未來的發(fā)展方向是：1)提高打印精度，滿足納米尺度的仿生，從而實(shí)現(xiàn)更有效的組織修復(fù)，即結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)；2)開發(fā)高性能的3D打印材料，能夠?qū)⑸锵嗳菪?、可降解性和機(jī)械性能三者兼顧；3)探索更多有效的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，適應(yīng)細(xì)胞微環(huán)境的結(jié)構(gòu)[6], 從而促進(jìn)組織修復(fù)；4)模仿組織的復(fù)雜成分、結(jié)構(gòu)和功能；5)打印大尺寸、功能化的組織和器官。