不同磷濃度對土壤理化性質(zhì)及防風生長和藥材品質(zhì)的影響

郝 佳，劉宇航，殷 潔，劉 晶，田 新，韓忠明，王云賀，韓 梅，楊利民

(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院/吉林省生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理重點實驗室,吉林 長春 130118)

土壤理化性質(zhì)是衡量土壤綜合生產(chǎn)力的重要指標，對作物產(chǎn)量和品質(zhì)起著關(guān)鍵性作用，研究表明，土壤有效養(yǎng)分(尤其是土壤堿解氮、有效磷和速效鉀)與作物品質(zhì)及養(yǎng)分吸收量間存在一定的相關(guān)關(guān)系[1]。對藥用植物而言，土壤養(yǎng)分是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要環(huán)境因子。在實際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，尤其在逆境條件下，藥用植物栽培前后土壤養(yǎng)分變化非常明顯[2-3]，導致藥材質(zhì)量也具有一定差異。磷素是植株生長所需的大量元素之一，主要作用是促進根系生長和果實發(fā)育，但在我國乃至全球的環(huán)境下，磷素一直處于嚴重匱乏的狀況，研究表明，當磷供給不能滿足植物生長時，會出現(xiàn)植株新陳代謝受阻、生長繁殖遲緩、對環(huán)境的不良刺激抗逆性變?nèi)醯劝Y狀[4]。當土壤全磷質(zhì)量分數(shù)低于0.03%時，土壤往往表現(xiàn)缺少有效磷。因此，在磷脅迫下，植物會形成一系列的響應策略，同時土壤養(yǎng)分含量的變化反過來影響著藥用植物的生長發(fā)育及藥材質(zhì)量。

防風Saposhnikovia divaricata是我國常用大宗中藥材之一，以未抽薹的干燥根入藥，具有解表祛風、勝濕、止痙等作用[5]，其主要藥效成分為色原酮類，主要包括升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷等[6-8]。近年來，對防風的水分、光照以及化學成分等方面研究較多[8-11]，而不同磷濃度處理對防風影響的研究鮮見報道。本研究以2年生防風為試驗材料，就不同磷濃度對防風生長特性、4種色原酮總含量及土壤理化性質(zhì)的影響開展研究，揭示防風對低磷環(huán)境的響應，旨在為吉林省西部缺磷環(huán)境條件下防風人工栽培技術(shù)策略的制定以及防風對低磷環(huán)境響應機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學人工氣候室內(nèi)，采用室內(nèi)圓柱沙培的方式進行試驗，柱高50 cm，口徑10 cm，每桶裝洗凈的沙子3.3 kg，沙子的有效磷、速效鉀、堿解氮質(zhì)量分數(shù)分別為0.05、47.06、22.15 mg/kg，有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為 0.57 mg/g。2019年6月播種，期間保證水分充足，7月齊苗后，每柱定苗1株。

1.2 試驗設計

參考全國以及分布區(qū)內(nèi)防風土壤中有效磷含量，試驗共設計了3個磷濃度處理，采用Hoagland營養(yǎng)液澆灌[12-13]的方式供應營養(yǎng)液，營養(yǎng)液的磷(NH4H2PO4) 濃度分別為 1.0、0.1 和 0 mmol/L，其他營養(yǎng)元素供應均相同。2020年6月15日開始供應營養(yǎng)液，每個處理的營養(yǎng)液澆灌時間均相同，每10天1次，每柱澆灌營養(yǎng)液100 mL，每個處理設置 50 柱。分別于處理 30 、60 和 90 d 采土樣，每個處理隨機取防風10株。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤指標測定 將土壤自然晾干后，過篩，pH、電導率 (κ) 采用pH計法測定，有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀含量采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定[14]，酸性磷酸酶活性采用苯磷酸二鈉法測定[15]。

1.3.2 生長指標測定 防風樣品置于冰盒中帶回實驗室，用流水迅速清洗干凈，吸干表面水分，分別測量防風根長、根粗，并稱量根鮮生物量，烘干后稱量根干生物量。

1.3.3 4種色原酮總含量測定 將干燥的防風根用粉碎機粉碎，過100目篩，精確稱取0.5 g樣品，加入φ為70%的乙醇15 mL，在微波萃取儀中，90 ℃條件下提取 3 min，收集濾液，采用 Agilent 1 260 高效液相色譜儀測定4種色原酮的總含量，4種色原酮分別為升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷。色譜條件：色譜柱為 Diamonsil C18(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，柱溫 30 ℃，檢測波長 254 nm。甲醇-水梯度洗脫：0～15 min，φ為 20%～45% 的甲醇；15～25 min，φ為 45%～70% 的甲醇。流速 1 mL/min[6,16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2010對原始數(shù)據(jù)進行整理，采用DPS12.01統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用 Origin 9.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷濃度對防風土壤理化性質(zhì)的影響

2.1.1 不同磷濃度對防風土壤養(yǎng)分含量的影響如圖1所示，土壤pH(圖1A)在處理30 d時3種磷濃度處理間存在顯著差異，無磷處理的pH 顯著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷處理，隨著處理時間的延長，60 d 時 0.1 mmol·L-1和無磷處理的 pH 顯著降低，較 30 d 時分別降低了約 12%，90 d 時 0.1 mmol·L-1和無磷處理的 pH 顯著低于 1.0 mmol·L-1磷處理，分別降低了7%和12%，3種處理間差異顯著。土壤電導率 (圖1B) 在整個試驗期間表現(xiàn)為 1.0 mmol·L-1磷處理顯著高于無磷處理，在 30、60 和 90 d 時分別為無磷處理的2.14、1.64 和2.03 倍。土壤有機質(zhì)含量(圖1C) 在整個試驗期間表現(xiàn)為無磷處理顯著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷處理，在 30、60 和 90 d時，無磷處理的土壤有機質(zhì)含量較1.0 mmol·L-1磷處理分別提升了 1.23、0.72 和 1.63 倍，較 0.1 mmol·L-1磷處理分別提升了0.78、0.74和0.61倍。

處理30 d時土壤堿解氮含量(圖1D)表現(xiàn)為無磷處理顯著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷處理，60 d時3種處理間無顯著差異，90 d 時各處理的堿解氮含量均升為最大值，且無磷處理顯著高于1.0和0.1 mmol·L-1磷處理，分別為 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷處理的1.35和1.44 倍。土壤有效磷含量(圖1E) 在處理 30 和 60 d 時表現(xiàn)為 0.1 mmol·L-1和無磷處理顯著低于 1.0 mmol·L-1磷處理，且分別較 1.0 mmol·L-1磷處理下降了約 34% 和63%，隨著處理時間的延長，90 d時的土壤有效磷含量積累到最大值，且0.1 mmol·L-1磷處理顯著高于無磷處理。0.1 mmol·L-1和無磷處理的速效鉀含量(圖1F) 在整個處理期間無顯著差異，在 30 d 時 1.0 mmol·L-1磷處理的速效鉀含量顯著高于 0.1 mmol·L-1和無磷處理。

圖1 不同磷濃度對防風土壤理化性質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of different phosphorus concentrations on physicochemical properties of soil in which Saposhnikovia divaricata was grown

2.1.2 不同磷濃度對防風土壤酸性磷酸酶活性的影響 磷酸酶活性是評價土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向及強度的指標，酸性磷酸酶參與有機磷的轉(zhuǎn)化，因此被認為是研究低磷脅迫下磷代謝的重要酶[17]。如圖2可知，2年生防風根系土壤中酸性磷酸酶活性在處理 30 d 時為無磷處理＞0.1 mmol·L-1磷處理＞1.0 mmol·L-1磷處理，3 種處理間存在顯著差異，處理60 和90 d時3種處理間無顯著差異。因此，試驗初期，缺磷 (0.1 mmol·L-1和無磷)處理下，防風增加酸性磷酸酶的分泌，以此轉(zhuǎn)化更多的無機磷供自身吸收利用。

圖2 不同磷濃度對防風土壤酸性磷酸酶活性的影響Fig. 2 Effects of different phosphorus concentrations on acid phosphatase activity of soil in which Saposhnikovia divaricata was grown

2.2 不同磷濃度對防風生長的影響

如圖3可知，根長(圖3A)在處理30 d時3種磷濃度無顯著差異，處理60 d時無磷處理的根長顯著高于 0.1 mmol·L-1磷處理，90 d 時無磷處理的根長顯著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷處理，均高出12% 左右。根粗(圖3B) 表現(xiàn)為在整個試驗期間1.0 mmol·L-1磷處理高于 0.1 mmol·L-1和無磷處理，30 d 時 1.0 mmol·L-1磷處理與無磷處理之間存在顯著差異，根粗增加，3種磷水平間差異縮??；根鮮生物量 (圖3C)在處理 30 d 時 1.0 mmol·L-1磷處理顯著高于 0.1 mmol·L-1和無磷處理；根干生物量 (圖3D) 在整個試驗期間表現(xiàn)為 1.0 mmol·L-1磷處理顯著高于無磷處理。說明，磷脅迫(無磷處理)下2年生防風地下部分生長受到了限制，根生物量顯著降低。

圖3 不同磷濃度對防風生長的影響Fig. 3 Effects of different phosphorus concentrations on growth of Saposhnikovia divaricata

2.3 不同磷濃度對防風藥材品質(zhì)的影響

由圖4可以看出，處理30和60 d時防風4種色原酮總含量在3個磷濃度間無顯著差異，處理90 d時 0.1 mmol·L-1和無磷處理的 4 種色原酮總含量顯著高于1.0 mmol·L-1磷處理，且分別高出59%和46%。結(jié)果表明，防風在長期的磷脅迫下，會通過增加次生代謝產(chǎn)物色原酮來適應外界環(huán)境。

圖4 不同磷濃度下防風4種色原酮總含量變化Fig. 4 Changes in total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata in different phosphorus concentrations

2.4 土壤理化性質(zhì)、防風生長指標與4種色原酮總含量的相關(guān)關(guān)系

2.4.1 相關(guān)性分析 不同磷濃度處理下土壤理化性質(zhì)、防風生長指標和4種色原酮總含量的相關(guān)關(guān)系見圖5，從圖5中可以看出，1.0 mmol·L-1磷處理下，堿解氮、有效磷含量與4種色原酮總含量存在極顯著負相關(guān)(P＜0.01)，根長與4種色原酮總含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，根鮮質(zhì)量與4種色原酮總含量呈正相關(guān)，其他各指標均與4種色原酮總含量呈負相關(guān)；0.1 mmol·L-1磷處理下，pH、堿解氮含量、酸性磷酸酶活性與4種色原酮總含量呈正相關(guān)，其他指標均與4種色原酮總含量呈負相關(guān)；無磷處理下，堿解氮、有效磷含量和根鮮生物量與4種色原酮總含量呈正相關(guān)，其他指標與色原酮含量存在負相關(guān)。

圖5 不同磷濃度下的土壤理化性質(zhì)、防風生長指標與4種色原酮總含量的相關(guān)關(guān)系Fig. 5 Correlation between soil physicochemical property,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

2.4.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 表1為不同磷濃度處理下土壤理化性質(zhì)、防風生長指標與4種色原酮總含量的灰色關(guān)聯(lián)度矩陣。從表1中可以看出，1.0 mmol·L-1磷處理下，各因子與4種色原酮總含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)在0.270～0.496之間，與4種色原酮總含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)最大的為根長；0.1 mmol·L-1磷處理下，各因子與4種色原酮總含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)在0.297～0.459之間，與4種色原酮總含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)最大的為酸性磷酸酶活性；無磷處理下，各因子與4種色原酮總含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)在0.292～0.524之間，pH和根長是與4種色原酮總含量關(guān)聯(lián)系數(shù)最大的2個因子，分別為0.524和0.500。

表1 不同磷濃度下的土壤因子、防風生長指標與4種色原酮總含量的灰色關(guān)聯(lián)度分析Table 1 Grey correlation analysis between soil factors,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

2.4.3 通徑分析 通徑分析可將相關(guān)系數(shù)分解為直接作用和間接作用，從而清楚地顯示各因素的相關(guān)關(guān)系。從表2中可以看出：1.0 mmol·L-1磷處理下，電導率、根粗、根鮮生物量對防風4種色原酮總含量的直接通徑系數(shù)為正值，有機質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量及酸性磷酸酶活性、pH、根長、根干質(zhì)量對防風4種色原酮總含量的直接通徑系數(shù)為負值；0.1 mmol·L-1磷處理下，僅有根鮮質(zhì)量對防風4種色原酮總含量的直接通徑系數(shù)為正值，其他指標均為負值；無磷處理下，有機質(zhì)和堿解氮含量及根長、根鮮質(zhì)量對防風藥材4種色原酮總含量的直接通徑系數(shù)為正值，pH、電導率、酸性磷酸酶活性、根粗、根干質(zhì)量以及有效磷和速效鉀含量對防風藥材品質(zhì)的直接通徑系數(shù)均為負值。

表2 不同磷濃度下的土壤理化性質(zhì)、防風生長指標與4種色原酮總含量的通徑系數(shù)1)Table 2 Path coefficient between soil factors,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

從間接通徑系數(shù)來看，1.0 mmol·L-1磷處理下，x10(速效鉀含量)→(通過)x6(電導率)→y(4種色原酮總含量)、x11(酸性磷酸酶活性)→x6→y、x7(有機質(zhì)含量)→x6→y的間接通徑系數(shù)為正，且位列前3，分別為 0.362、0.350 和 0.333；x9(有效磷含量)→x8(堿解氮含量)→y、x11→x10→y、x9→x5(pH)→y的間接通徑系數(shù)為負，且其絕對值位列前3，分別為-0.444、-0.192、-0.139。

0.1 mmol·L-1磷處理下，x10→x5→y、x5→x6→y、x6→x5→y的間接通徑系數(shù)為正，且位列前3，分別為0.391、0.390、0.369；x10→x6→y、x11→x6→y、x7→x6→y的間接通徑系數(shù)為負，且其絕對值位列前3，分別為-0.507、-0.380、-0.315。

無磷處理下，x5→x2(根粗)→y、x11→x9→y、x6→x5→y的間接通徑系數(shù)為正，且位列前3，分別為0.994、0.942、0.840；x4(根干生物量)→x2→y、x3(根鮮生物量)→x2→y、x6→x2→y的間接通徑系數(shù)為負，且其絕對值位列前3，分別為-0.710、-0.588、-0.567。

3 討論與結(jié)論

植物的生長發(fā)育與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)[18]，除受自身遺傳因素控制外，藥用植物生長特性、藥效成分與土壤養(yǎng)分也密切相關(guān)，藥效成分多為次生代謝產(chǎn)物，是植物與環(huán)境在長期進化過程中相互作用的結(jié)果，更加容易受到外界環(huán)境的影響。磷素是影響植物生理活動的重要生態(tài)因素，土壤中的磷素有效性高低與土壤對磷的吸附-解吸、沉淀-溶解等過程有關(guān)，而這些過程又取決于氣候條件、土壤理化性質(zhì)等因素[19]。前人研究發(fā)現(xiàn)，進入土壤中的磷素有效性不僅受土壤理化性質(zhì)影響，反過來低磷或缺磷的環(huán)境下，植物根系也會啟動一系列的覓磷策略，從而抵御不良環(huán)境，例如增加有機酸的分泌，通過其絡合或螯合作用活化土壤中難溶的營養(yǎng)成分供自身吸收利用，反過來也影響土壤理化性質(zhì)[20]，或者改變根系生物量及形態(tài)特征，從而影響根系對營養(yǎng)成分的吸收。

本研究發(fā)現(xiàn)，防風根系土壤pH在7.04～7.99之間，呈弱堿性，處理30 d 時無磷處理的pH顯著高于1.0和0.1 mmol·L-1磷處理，隨著處理時間延長，60 和 90 d 時 0.1 mmol·L-1和無磷處理的 pH 降低，且顯著低于 1.0 mmol·L-1磷處理，90 d 時更是表現(xiàn)出3 種處理間pH存在顯著差異。pH是影響植物對土壤中難溶磷進行活化的重要因素，有學者研究表明，在一定范圍內(nèi)，隨著根際土壤pH的下降，植物對磷的吸收會顯著增加[21]，本研究結(jié)果表明，0.1 mmol·L-1和無磷處理下 2 年生防風處于缺磷狀態(tài)，要通過提高自身對土壤中磷的獲取，才能滿足植株的生長以及各項生理活動對磷的需求，因此0.1 mmol·L-1和無磷處理下防風根系不斷分泌有機酸等物質(zhì)，導致處理后期低磷脅迫下土壤pH顯著低于 1.0 mmol·L-1磷處理，這與劉曉霞[22]、謝安強等[23]的研究結(jié)果一致。植物根系分泌物和土壤pH的相互作用之間存在動態(tài)平衡，并受多方面因素共同調(diào)節(jié)，Chen等[24]提出有機質(zhì)、堿解氮等物質(zhì)含量與維持土壤微生態(tài)平衡之間關(guān)系密切，本研究發(fā)現(xiàn)，防風在磷脅迫下，土壤有機質(zhì)、堿解氮含量積累增加，這可能是一方面低磷環(huán)境使得土壤中微生物的數(shù)量和活性受到了抑制，因此減緩了有機質(zhì)等的消耗，另一方面，也可能是有機酸和其他螯合劑的分泌增多，將土壤中難溶的部分釋放為可溶態(tài)，因此使土壤中的速效養(yǎng)分含量增多，同時， 0.1 mmol·L-1和無磷處理在長時間的磷脅迫下，防風根系可吸收的磷不足，根表面積和生物量減小，進一步抑制了根系對氮的吸收，導致無磷處理下防風根際土壤中堿解氮的含量顯著高于其他2個處理，這與李榮坦[25]研究結(jié)果相一致。

酸性磷酸酶是重要的水解酶，也是誘導酶，它不僅在植物碳水化合物轉(zhuǎn)化及蛋白質(zhì)合成中起重要作用，還與土壤中有機磷的分解和再利用有密切聯(lián)系。徐靜等[26]研究表明，大麥根際土壤酸性磷酸酶活性在不施磷以及磷質(zhì)量分數(shù)為30 mg/g的土壤中顯著高于磷質(zhì)量分數(shù)為90 mg/g的土壤。本試驗通過分析發(fā)現(xiàn)，防風根系土壤中酸性磷酸酶活性在處理 30 d 時表現(xiàn)為無磷處理＞0.1 mmol·L-1磷處理＞1.0 mmol·L-1磷處理，說明試驗初期防風在低磷環(huán)境下酸性磷酸酶分泌增多，使得土壤中酸性磷酸酶活性提高，從而提高防風對低磷環(huán)境的適應性。

無磷處理下，2年生防風的根粗、根生物量在整個處理期間均低于1.0 mmol·L-1磷處理，這與郭軼敏等[27]研究結(jié)果低磷脅迫下柱花草Stylosanthes guianensis的生物量總體呈下降趨勢相一致，但是無磷處理下防風的根長隨著處理時間的延長逐漸增加，在處理3個月時顯著高于1.0 mmol·L-1磷處理，說明2 年生防風長期在無磷脅迫處理下，為滿足自身生長需求，通過增加根長來增加與土壤的接觸面積，吸收更多的養(yǎng)分，這與Liu等[28]研究結(jié)果相一致，即植物可以通過增加根長來提高植株對低磷脅迫的耐受。

中藥材藥效成分的含量由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定，遺傳因素決定其是否具有合成藥效成分的能力，而環(huán)境因素決定其藥效成分的含量高低[29]。韓忠明等[8]研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)哪婢趁{迫有助于提高中藥材有效成分含量及藥材品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，在整個處理期間，0.1 mmol·L-1和無磷處理下防風的 4 種色原酮含量高于 1.0 mmol·L-1磷處理，特別是 90 d 時，0.1 mmol·L-1和無磷處理的 4 種色原酮含量顯著高于1.0 mmol·L-1磷處理。相關(guān)性分析和灰色關(guān)聯(lián)度分析表明，1.0 mmol·L-1磷處理下，堿解氮和有效磷含量與4 種色原酮總含量存在極顯著負相關(guān)關(guān)系，與通徑分析結(jié)果相一致；0.1 mmol·L-1磷處理下酸性磷酸酶活性是影響4 種色原酮總含量的最大因子；無磷處理下土壤pH和根長是與4種色原酮總含量關(guān)聯(lián)系數(shù)最大的2個因子，通徑分析結(jié)果進一步確定了根長對防風4種色原酮總含量是正向促進作用，土壤pH對防風4種色原酮總含量是負向作用。說明低磷脅迫下，防風通過改變代謝途徑維持其基本生長的需要，根長增加、有機酸的釋放以及酸性磷酸酶的分泌致使pH降低，從而促進磷素的吸收、轉(zhuǎn)運和有效利用，進而影響防風次生代謝水平，因此土壤pH對防風4種色原酮總含量的影響是負向作用，而根長對防風4種色原酮總含量的影響是正向促進作用。

3種磷濃度下防風生長狀況、土壤理化性質(zhì)與4種色原酮總含量之間并不是簡單的相關(guān)關(guān)系，它們通過協(xié)同作用共同維持防風正常生長，以減輕低磷脅迫給防風造成的危害。因此，防風面對磷脅迫有一系列的響應機制，在磷脅迫下，防風對土壤有機質(zhì)和堿解氮的吸收利用減弱，但通過增加根長及有效成分總色原酮的含量，在試驗初期增加酸性磷酸酶的分泌，從而改變土壤的pH、活化土壤中難溶的營養(yǎng)成分供自身吸收利用，以提高對低磷環(huán)境的適應性。本研究結(jié)果能夠為防風人工栽培技術(shù)策略的制定以及防風對低磷脅迫響應機制的研究提供理論依據(jù)。但本研究僅限于室內(nèi)盆栽試驗，試驗結(jié)果需進一步開展大田試驗研究進行驗證。