Foxp3和SMARCE1在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

周有儉，劉曙光，龍嘉莉，曾超

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518033)

在全世界范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)生率和致死率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中均為第一[1]。隨著臨床技術(shù)水平的提升，宮頸癌在診療方案已取得突破性進(jìn)展(如手術(shù)方式、放化療等)，顯著提高早期宮頸癌患者預(yù)后。但對(duì)于進(jìn)展期的宮頸癌患者，現(xiàn)有臨床治療方案的療效難以進(jìn)一步提高[2]。宮頸癌發(fā)病相關(guān)分子較為復(fù)雜，探索與發(fā)病相關(guān)的新分子標(biāo)志物對(duì)于宮頸癌的預(yù)防及靶向治療尤為重要。

叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)的表達(dá)，通過誘導(dǎo)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞功能紊亂，誘導(dǎo)癌細(xì)胞免疫逃逸[3-4]。除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg細(xì)胞)表達(dá)Foxp3外，肺癌、腸癌和膠質(zhì)瘤等部分實(shí)體腫瘤細(xì)胞中也存在不同水平的表達(dá)[5-9]；SMARCE1的表達(dá)與乳腺癌、卵巢癌和胃癌患者的預(yù)后相關(guān)，并且SMARCE1是促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因[10-14]。本研究擬探討 Foxp3、SMARCE1蛋白的表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2020年12月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科收治的60例宮頸癌患者作為研究組，同時(shí)選取同期30例慢性宮頸炎組織作為對(duì)照組。研究組中，年齡35～58歲，平均(46.5±0.8)歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)15例，包括CIN1級(jí)4例、CIN2級(jí)6例、CIN3級(jí)5例。對(duì)照組中，年齡 30～55歲，平均(42.5±0.4)歲。

1.2 組織芯片制作

對(duì)每例組織標(biāo)本，先在蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)切片上確定典型的組織，并在相應(yīng)的蠟塊上作好標(biāo)記，將組織轉(zhuǎn)移蠟?zāi)Ｖ?。?7.5 g石蠟和2.5 g蜂蠟混合，反復(fù)加溫溶解，冷卻數(shù)次，制成空白蠟塊。在該蠟塊范圍內(nèi)組織陣列，用組織儀打孔(0.6 mm)制成組織微陣列模塊。將構(gòu)建好的組織芯片蠟塊放入55 ℃ 溫箱中約1～2 h，在蠟將要完全溶解前取出，室溫下冷卻，使蠟與新插入的小圓柱狀組織融為一體，取下蠟塊，于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化

于二甲苯中將組織芯片脫蠟，梯度酒精水化。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，抗原修復(fù)后甩干。Foxp3一抗(德國(guó)Santa 公司，sc-53876，濃度1∶50)； SMARCE1一抗(英國(guó)abcam公司，ab131328，濃度1∶100)，室溫孵育3 h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色，蘇木素染色，封片。選取20個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，對(duì)癌細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：無著色為0分，淺黃色1分，黃色2分，棕色3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例得分之和≥3分記為陽(yáng)性。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

從HeLa細(xì)胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人Foxp3(NM_014009.4)全長(zhǎng)互補(bǔ)/拷貝脫氧核糖核酸(cDNA)。引物序列設(shè)計(jì)：Foxp3-F∶5-′TGGTACCGAGCTCGCCACCATGCCCACCAGGCCTGGCAAG-3′；Foxp3-R∶5-′GATATCTGCAGAATTCTCAGGGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′。將Foxp3 DNA片段克隆入pcDNA3.1構(gòu)建重組pcDNA3.1-Foxp3質(zhì)粒。用Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)將空質(zhì)粒pcDNA3.1和過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Foxp3轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

提取各組宮頸癌細(xì)胞蛋白，取上清液采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入5×Loading Buffer煮沸后，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，用1∶1 000稀釋后的一抗過夜孵育，次日選擇辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)染色條帶的強(qiáng)度，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參蛋白的光密度比值。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

室溫下4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，室溫下0.5% Triton X-100浸潤(rùn)20 min，然后與一抗孵育。主要使用的抗體如下： Foxp3 (1∶50稀釋，德國(guó)santa)， smarce1 (1∶100稀釋，英國(guó)abcam)。4 ℃ 孵育過夜，加熒光二抗，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

測(cè)序確定SMARCE1啟動(dòng)子片段(在5-3 bp和452-460 bp區(qū)域)并克隆到pGL3-Basic載體(Wisconsin，Promega)中。將細(xì)胞接種于24孔板，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含有螢火蟲熒光素酶報(bào)告子和重組啟動(dòng)子報(bào)告子的質(zhì)粒。熒光素酶活性在孵育24 h后，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧海)進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)染效率以Renilla熒光素酶活性為標(biāo)準(zhǔn)。特異性啟動(dòng)子活性表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的變化。

1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是依照ChIP檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Epigentek)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。5 μg Foxp3抗體(英國(guó)Abcam)和20 μL完全重懸蛋白A/G磁珠免疫沉淀染色質(zhì)-蛋白復(fù)合物。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)擴(kuò)增感興趣區(qū)域或內(nèi)部陰性控制區(qū)。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的分析，沉淀的DNA的數(shù)量計(jì)算為輸入樣品的百分比。用于Chip-qPCR定量分析的引物列為：SMARCE1 F∶5′-TGTCAAAATCTCCACCCTGATG-3′；SMARCE1 R∶5′-CCACCACACCCTGCTAATTT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料以頻數(shù)表示，組間比較使用U檢驗(yàn)；Foxp3和SMARCE1 表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組織Foxp3、SMARCE1陽(yáng)性表達(dá)率比較

研究組Foxp3和SMARCE1陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 兩組Foxp3和SMARCE1表達(dá)比較[n(%)]

2.2 研究組中Foxp3和SMARCE1表達(dá)與宮頸癌臨床病理關(guān)系

Foxp3蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于宮頸癌腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞也可見陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)與宮頸癌的TNM分期相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。SMARCE1蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物也主要定位于宮頸癌腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，SMARCE1蛋白與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，但與年齡、腫瘤分化程度和臨床分期無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 研究組中Foxp3和SMARCE1表達(dá)與宮頸癌各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n(%)]

2.3 研究組中Foxp3和SMARCE1在宮頸癌組織中表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)分析顯示Foxp3和SMARCE1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.894，P<0.05)。見表3。

表3 研究組中Foxp3和SMARCE1在宮頸癌組織中表達(dá)相關(guān)性

2.4 SMARCE1在宮頸CIN組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，SMARCE1在CIN1級(jí)組織中呈陰性表達(dá)，而SMARCE1在CIN3(原位癌)級(jí)組織中的染色強(qiáng)度和染色范圍強(qiáng)于其在CIN2級(jí)組織中的表達(dá)，表明SMARCE1在宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)強(qiáng)于其在低級(jí)別上皮瘤病變，提示SMARCE1可能參與了宮頸癌的進(jìn)展。見圖2。

2.5 Foxp3調(diào)控宮頸癌細(xì)胞中SMARCE1表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與SiHa細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組相比，增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞SiHa 中Foxp3表達(dá)后，SMARCE1表達(dá)隨之上調(diào)。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未處理組和對(duì)照組相比，上調(diào)SiHa細(xì)胞中Foxp3表達(dá)后，SMARCE1的熒光信號(hào)也隨之增強(qiáng)。見圖3。

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與pGL-basic-SMARCE1報(bào)告基因和對(duì)照載體的共轉(zhuǎn)染相比，共轉(zhuǎn)染Foxp3過表達(dá)質(zhì)粒和pGL-basic-SMARCE1報(bào)告基因顯著提高了螢火蟲對(duì)renilla熒光素酶活性的比率。本研究進(jìn)一步利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與SMARCE1基因相互作用的位置。SMARCE1啟動(dòng)子的5-13 bp和452-460 bp區(qū)域是Foxp3激活的關(guān)鍵區(qū)域。將Foxp3抗體沉淀的DNA進(jìn)行凝膠電泳和qPCR檢測(cè)，以確定轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與SMARCE1啟動(dòng)子之間的關(guān)系。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子Foxp3可直接結(jié)合到SMARCE1啟動(dòng)子區(qū)域，F(xiàn)oxp3過表達(dá)可使Foxp3更多地結(jié)合到SMARCE1啟動(dòng)子區(qū)域。因此，F(xiàn)oxp3可轉(zhuǎn)錄激活宮頸癌細(xì)胞中SMARCE1的表達(dá)。見圖4。

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，腫瘤的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移常提示預(yù)后差。晚期宮頸癌患者復(fù)發(fā)率高，化療耐藥，導(dǎo)致其生存率更低。因而探尋宮頸癌進(jìn)展中的分子標(biāo)志物，可為臨床宮頸癌的免疫靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

Foxp3 能抑制 CD4+T 淋巴細(xì)胞功能，阻礙 T 細(xì)胞的抗原提呈作用，降低自然殺傷性T淋巴細(xì)胞對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。表達(dá)Foxp3的胃癌細(xì)胞可起到了模擬Treg細(xì)胞功能的作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸；Foxp3在惡性上皮性腫瘤組織中的表達(dá)顯著強(qiáng)于其在卵巢良性、交界性上皮性腫瘤中的表達(dá)[15]；SMARCE1高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，影響患者的預(yù)后[10]。目前關(guān)于Foxp3和SMARCE1在宮頸癌進(jìn)展中的作用及其臨床意義的研究甚少。

本研究中，研究組宮頸癌病灶組織中Foxp3和SMARCE1的表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組的正常宮頸組織，且臨床分期較晚的患者中Foxp3和SMARCE1的表達(dá)陽(yáng)性率較高，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SMARCE1的表達(dá)異常高，提示了 Foxp3和SMARCE1等的異常表達(dá)均可能參與到了宮頸癌發(fā)生發(fā)展，與Sethuraman等[11]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步利用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，SMARCE1在宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)強(qiáng)于其在低級(jí)別上皮瘤病變中的表達(dá)，提示SMARCE1在宮頸癌的癌前病變中也起著重要的作用，很有可能在宮頸癌的癌變過程中起著關(guān)鍵性的促進(jìn)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞中Foxp3表達(dá)后，SMARCE1表達(dá)也隨之上調(diào)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Foxp3通過激活SMARCE1啟動(dòng)子區(qū)域激活SMARCE1表達(dá)?？傊?，本實(shí)驗(yàn)表明Foxp3/ SMARCE1通路在宮頸癌的癌變過程和發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中均起著重要的作用。但是，本研究?jī)H為單中心、小樣本研究，后續(xù)仍需進(jìn)行多中心、大樣本研究以進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論。此外，本研究未闡明Foxp3和SMARCE1蛋白通過何種作用機(jī)制參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，后續(xù)仍需開展更深入的生物學(xué)研究以進(jìn)一步明確相關(guān)作用途徑。

綜上所述，宮頸癌中Foxp3和SMARCE1蛋白的表達(dá)成正相關(guān)，F(xiàn)oxp3可通過轉(zhuǎn)錄激活SMARCE1表達(dá)，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。