熱習(xí)服訓(xùn)練對(duì)勞力性熱射病大鼠肝保護(hù)作用機(jī)制研究

郭俊峰， 王蓓蓓， 王 玲， 葛 鳳， 柳云恩,3， 叢培芳,3 ， 金紅旭， 高 燕北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院.急診醫(yī)學(xué)部；3.全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 006；2.大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 6044

勞力性熱射病(exertional heatstroke,EHS)作為一種嚴(yán)重的物理因素致病性疾病，發(fā)病率正伴隨惡劣天氣發(fā)生率增高而增高[1]。2003年歐洲高溫天氣導(dǎo)致法國(guó)死亡的15 000余人中，大部分死于經(jīng)典型熱射病(classic heatstroke,CHS)和EHS[2]。EHS起病急、進(jìn)展快、致死和致殘率高且好發(fā)于青壯年，受到臨床重視[3]。EHS早期即可表現(xiàn)為多臟器功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、肝、橫紋肌受累頻率最高。

目前,EHS引起臟器損傷的機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，主要有“類(lèi)膿毒癥”學(xué)說(shuō)、熱損傷學(xué)說(shuō)、缺血再灌注學(xué)說(shuō)等[4]。EHS患者存在廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而內(nèi)皮細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞是肝清除系統(tǒng)的重要組成成分[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成的屏障功能缺失是導(dǎo)致熱射病后繼發(fā)感染的重要因素之一[6]。此外，在線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體的質(zhì)量與功能的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)尤為關(guān)鍵，線(xiàn)粒體可通過(guò)生物發(fā)生和自噬消除維持其質(zhì)量與數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡[7-8]。關(guān)于線(xiàn)粒體自噬的研究中，以針對(duì)PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/Parkin途徑的研究較多，PINK1/Parkin途徑已被證實(shí)與神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病)關(guān)系密切[9]。但有關(guān)PINK1/Parkin途徑與EHS致肝損傷相關(guān)研究較少。此外，熱習(xí)服訓(xùn)練(heat acclimation training，HAT)已被證實(shí)可降低EHS的發(fā)病率[10]。本研究將對(duì)HAT、PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬與EHS致肝損傷的關(guān)系進(jìn)行探究，旨在為EHS的防治提供新的觀點(diǎn)及思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65只清潔級(jí)成年雄性SD大鼠(8周齡，200～220 g)均購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，于晝夜交替12 h/12 h環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間自由進(jìn)食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立 將65只SD大鼠分為對(duì)照組(Con組，n=6)、EHS組(n=44)、熱習(xí)服組(HA組，n=15)。所有組均進(jìn)行3 d適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練，跑臺(tái)速度由10 m/min梯次遞增至15 m/min，測(cè)定跑臺(tái)前后體質(zhì)量、直腸溫度(Tre)。HA組適應(yīng)性跑臺(tái)后休息2 d，再進(jìn)行3次高溫跑臺(tái)訓(xùn)練，每次20 min。EHS組和HA組完成訓(xùn)練后進(jìn)行高溫跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，記錄跑臺(tái)前體質(zhì)量、Tre，跑臺(tái)開(kāi)始15、25、30 min時(shí)Tre，30 min后每5 min記錄一次Tre，直至Tre≥42.0℃，記錄大鼠體質(zhì)量、Tre、翻正反射等特征。

1.3 主要試劑 通用二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(小鼠/兔)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司；阿利新蘭-過(guò)碘酸-雪夫染色試劑盒、全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠抗大鼠β-actin、PINK1；兔抗大鼠核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)-p65、細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyto-c)、CD31；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗大鼠Parkin購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蘇木素-伊紅染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織病理學(xué)變化 每次隨機(jī)選取每組3只大鼠肝組織，使用10%中性福爾馬林固定液固定48 h后，按梯度乙醇-二甲苯脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(3 μm)后，按照二甲苯、梯度乙醇脫蠟復(fù)水，進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、脫水、中性樹(shù)脂封片、顯微鏡觀察。

1.4.2 AB-PAS染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝糖類(lèi)代謝變化 取1.4.1部分獲取的石蠟切片，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行AB-PAS染色、脫水、中性樹(shù)脂封片、顯微鏡觀察。

1.4.3 TUNEL染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝細(xì)胞凋亡水平 取1.4.1部分獲取的石蠟切片，按照二甲苯-無(wú)水乙醇-90%乙醇-75%乙醇進(jìn)行脫蠟復(fù)水后用20 μg/ml蛋白酶K進(jìn)行細(xì)胞膜通透，然后按照1∶9比例配置TUNEL工作液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)記，37℃孵育60 min，PBS漂洗后滴加DAPI 50 μl/片染核，抗衰減封片劑封片后使用熒光顯微鏡于暗室中觀察。

1.4.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠肝PINK1、Parkin、Cyto-c、NF-κB、CD31表達(dá)情況 每次隨機(jī)選取每組3只大鼠肝組織100 mg，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)BCA法進(jìn)行總蛋白定量后稀釋成1 mg/ml組織勻漿，加入5倍上樣緩沖液，100℃沸水浴中 5 min進(jìn)行蛋白變性。以10 μg/孔進(jìn)行垂直SDS-PAGE凝膠電泳，4℃環(huán)境中濕法轉(zhuǎn)移目標(biāo)蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉(2 h)后，按比例加入兔抗大鼠Parkin、Cyto-c、NF-κB、CD31一抗、小鼠抗大鼠PINK1、β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)PBST漂洗3次后加入稀釋后山羊抗兔(小鼠)二抗(1∶5 000)孵育2 h，PBST再次漂洗3次后，加入ECL工作液進(jìn)行顯色后，進(jìn)行熒光灰度分析。

1.4.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠肝CD34表達(dá)情況 取1.4.1部分獲取的石蠟切片，按照二甲苯-無(wú)水乙醇-90%乙醇-75%乙醇進(jìn)行脫蠟復(fù)水，用pH=6的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行滅活(10 min)，加入1 mg/ml BSA進(jìn)行封閉，滴加目標(biāo)一抗(75 μl/片)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗后加入反應(yīng)增強(qiáng)液反應(yīng)20 min，再次PBS漂洗后滴加增強(qiáng)型鼠/兔二抗室溫孵育20 min后添加DAB工作液顯色(鏡下觀察到出現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)終止顯色)，脫水、中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 Con組大鼠進(jìn)食、飲水狀態(tài)良好，翻正反射正常；EHS組和HA組發(fā)病時(shí)均出現(xiàn)拒食、拒水，翻正反射減弱甚至消失。

2.2 3組大鼠72 h存活率及EHS組、HA組大鼠發(fā)病時(shí)間、體高溫持續(xù)時(shí)間比較 EHS組、HA組的存活率、發(fā)病時(shí)間及核心體溫達(dá)40℃持續(xù)時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠72 h存活率及發(fā)病時(shí)間、體高溫持續(xù)時(shí)間比較

2.3 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)及糖類(lèi)物質(zhì)代謝情況觀察 HE染色結(jié)果顯示，與Con組比較，EHS組和HA組2 h和6 h均可觀察到肝細(xì)胞腫脹、胞漿淡染，并伴有肝血竇淤血，但HA組程度較EHS組程度輕。EHS組和HA組24 h均可觀察核周空泡形成。與EHS組比較，HA組24 h時(shí)核周空泡更多，但炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，48 h后EHS組和HA組鏡下可觀察到肝細(xì)胞空泡變性幾乎蔓延至全小葉。見(jiàn)圖1～3。

圖1 Con組肝組織形態(tài)(HE染色×20) 圖2 EHS組肝組織形態(tài)(HE染色×20；a.發(fā)病后2 h；b.發(fā)病后6 h；c.發(fā)病后24 h；d.發(fā)病后48 h；e.發(fā)病后72 h) 圖3 HA組肝組織形態(tài)學(xué)(HE染色×20；a.發(fā)病后2 h；b.發(fā)病后6 h；c.發(fā)病后24 h；d.發(fā)病后48 h；e.發(fā)病后72 h)

AB-PAS染色結(jié)果顯示，EHS組各時(shí)間點(diǎn)均可觀察到肝細(xì)胞內(nèi)糖類(lèi)物質(zhì)被染成紫紅色，2 h和72 h更為明顯，HA組與EHS組相比，僅72 h時(shí)觀察到胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯紫紅色。見(jiàn)圖4～6。提示勞力性熱射病發(fā)病后肝細(xì)胞糖類(lèi)代謝可能受到抑制。

2.4 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮細(xì)胞新生情況觀察 TUNEL染色結(jié)果顯示，EHS組和HA組6 h內(nèi)肝細(xì)胞均出現(xiàn)明顯凋亡，2 h內(nèi)EHS組肝細(xì)胞凋亡率明顯高于HA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖7。免疫組化及蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，EHS組和HA組大鼠在發(fā)生勞力性熱射病后其肝表達(dá)CD34程度隨時(shí)間進(jìn)展均有增高，其中，發(fā)病后2 h和24 h HA組CD34表達(dá)量顯著高于EHS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖4 Con組糖類(lèi)代謝情況(AB-PAS染色×20) 圖5 EHS組糖類(lèi)代謝情況(AB-PAS染色×20；a.發(fā)病后2 h；b.發(fā)病后6 h；c.發(fā)病后24 h；d.發(fā)病后48 h；e.發(fā)病后72 h) 圖6 HA組糖類(lèi)代謝情況(AB-PAS染色×20；a.發(fā)病后2 h；b.發(fā)病后6 h；c.發(fā)病后24 h；d.發(fā)病后48 h；e.發(fā)病后72 h)

表2 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞凋亡率

圖7 3組肝細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色×20；a.Con組；b.EHS組發(fā)病后2 h；c.HA組發(fā)病后2 h；d.EHS組發(fā)病后6 h；e.HA組發(fā)病后6 h)

表3 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝CD34表達(dá)情況

2.5 各組大鼠肝PINK1/Parkin通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax、NF-κB表達(dá)情況 根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與Con組相比，EHS組PINK1、Parkin表達(dá)量隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，24 h時(shí)出現(xiàn)上升，HA組PINK1表達(dá)在6 h時(shí)即出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HA組Parkin表達(dá)量自6 h開(kāi)始至72 h均顯著低于Con組，HA組自24 h開(kāi)始Cyto-c表達(dá)量明顯低于EHS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Con組相比，EHS組和HA組Bcl-2表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。EHS 組24 h Bax表達(dá)量明顯低于HA組和Con組，HA組72 h Bax表達(dá)量明顯低于Con組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HA組6 h至48 h NF-κB表達(dá)量顯著低于Con組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而CD31表達(dá)量雖有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 各組不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)(a.PINK1；b.Parkin;c.Bcl-2;d.Bax;e.Cyto-c;f.NF-κB;g.CD31)

3 討論

EHS的發(fā)生嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，臨床尚無(wú)特異性治療，主要以臟器支持和并發(fā)癥防治為主。因此，了解EHS致臟器損傷的病理生理學(xué)過(guò)程尤為重要。以往研究認(rèn)為，EHS的致病機(jī)制主要包含全身廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而肝內(nèi)皮系統(tǒng)較為發(fā)達(dá)，在EHS發(fā)病早期即可出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，造成廣泛的微血栓形成，使全身器官灌注不足加重、出血傾向增高[10]。此外，高熱還可直接導(dǎo)致代謝相關(guān)酶系功能異常，使得線(xiàn)粒體能量生成減少，干擾損傷修復(fù)。內(nèi)毒素等可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子，損傷內(nèi)皮屏障，導(dǎo)致病理性凝血，甚至彌散性血管內(nèi)凝血的發(fā)生[11-13]。此外，熱處理可降低NF-κB通路的活化，并可以減少超氧化物的產(chǎn)生[14]。在EHS的預(yù)防與治療相關(guān)指南中也認(rèn)為HAT可顯著降低EHS的發(fā)病率[10]。

本研究通過(guò)建立EHS大鼠動(dòng)物模型，模擬EHS的致肝損傷過(guò)程后發(fā)現(xiàn)，高熱可以直接影響線(xiàn)粒體有氧代謝過(guò)程，導(dǎo)致肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等糖類(lèi)利用障礙，細(xì)胞能量生成不足，NF-κB通路活化，加劇肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程。而PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬過(guò)程可通過(guò)改善受損的線(xiàn)粒體質(zhì)控過(guò)程，加速受損線(xiàn)粒體清除過(guò)程，降低細(xì)胞內(nèi)因線(xiàn)粒體受損的而產(chǎn)生的活性氧自由基等。此外，短時(shí)HAT雖不能改變EHS大鼠急性期病死率，但可以顯著改善因高熱導(dǎo)致的肝細(xì)胞能量代謝受損過(guò)程，降低NF-κB通路的活化。本研究在對(duì)EHS組和HA組大鼠肝進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和蛋白免疫印跡檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，HA組大鼠肝血管內(nèi)皮細(xì)胞新生標(biāo)志物CD34的表達(dá)量明顯增加，提示HAT可以明顯提高EHS大鼠肝血管內(nèi)皮損傷修復(fù)速度，從而降低肝微血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。

有研究表明，HAT可降低因藥物(如阿霉素、阿司匹林等)造成的肝損傷程度[15-17]；還可以通過(guò)激活肝細(xì)胞PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的自噬過(guò)程，改善肝術(shù)后的缺血/再灌注損傷[18-19]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道HAT可通過(guò)抑制AKT/ERK途徑，增強(qiáng)腫瘤血管生成能力[20-21]。在EHS性肝損傷過(guò)程中，HAT是否通過(guò)抑制AKT/ERK途徑發(fā)揮保護(hù)作用仍需進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，EHS導(dǎo)致的肝損傷嚴(yán)重影響生存率和預(yù)后，早期干預(yù)十分必要，本研究中發(fā)現(xiàn)HAT可顯著降低EHS大鼠肝損傷程度，發(fā)揮保護(hù)作用。其機(jī)制可能是激活PINK1/Parkin途徑介導(dǎo)的線(xiàn)粒體自噬過(guò)程，該發(fā)現(xiàn)可以為進(jìn)一步特異性治療EHS和藥物研發(fā)提供潛在靶點(diǎn)。