不同核心溫度下勞力性熱射病大鼠凝血功能障礙特征研究

竇建林， 宋景春， 余 甜， 吳 陽， 何龍平， 鐘林翠， 林青偉中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇八醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科/南昌市血栓與止血學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330002

勞力性熱射病(exertional heatstroke，EHS)指機(jī)體在高熱環(huán)境下進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)所造成的熱平衡障礙，臨床表現(xiàn)為可致死的急進(jìn)性多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，EHS患者凝血功能障礙的發(fā)生率可達(dá)40%～75%，且合并凝血功能障礙時(shí)，病死率可超過50%[3-4]。EHS相關(guān)的凝血功能障礙可表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝固時(shí)間延長、血小板功能障礙和纖溶活動(dòng)異常，嚴(yán)重者可出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)[5]。早期識別EHS相關(guān)凝血功能障礙并及時(shí)阻斷凝血功能障礙向DIC的演進(jìn)，是改善EHS合并凝血功能障礙患者預(yù)后的重要措施[6]。核心溫度過高是EHS導(dǎo)致凝血功能障礙的重要因素。發(fā)生EHS時(shí)，機(jī)體因熱代謝障礙導(dǎo)致核心溫度顯著升高，體液蒸發(fā)致有效血容量不足，凝血系統(tǒng)受到熱損傷和組織灌注不足雙重打擊，進(jìn)而出現(xiàn)凝血功能障礙[7]。對于不同核心溫度導(dǎo)致EHS相關(guān)凝血功能障礙嚴(yán)重程度的研究較少。本研究擬采用腹腔遙測溫度膠囊實(shí)時(shí)監(jiān)測大鼠核心體溫，并分析不同核心溫度EHS大鼠的凝血功能，以探討EHS相關(guān)凝血功能障礙特征，為EHS合并凝血功能障礙患者的干預(yù)時(shí)機(jī)提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器 選取SPF級SD大鼠25只，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK[湘]2019-0014)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d(5只/籠)，環(huán)境溫度24℃～25℃，相對濕度40%～50%，自由攝食、攝水。sv-223植入式遙測溫度膠囊(深圳菲明格科技有限公司)；KW-PT動(dòng)物跑步機(jī)、KW-PT-WS恒溫恒濕箱(南京卡爾文醫(yī)療科技有限公司)；BC-2600vet全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀器(深圳邁瑞醫(yī)療科技有限公司)；ACL-TOP700全自動(dòng)凝血分析儀(美國沃芬公司)；GEM premier3500-血?dú)夥治鰞x(美國沃芬公司)；匯松MB-530多功能酶標(biāo)儀(深圳匯松公司)。

1.2 遙測溫度膠囊植入術(shù) 25只大鼠均于建立EHS模型前1周完成遙測溫度膠囊腹腔植入術(shù)。術(shù)前24 h禁食，允許大鼠少量攝水。術(shù)前30 min，刺激大鼠排便并稱重。10%水合氯醛(0.02 ml/g)腹腔麻醉，將大鼠置于手術(shù)臺，消毒后于大鼠腹部前正中線切口，切口大小為1～2 cm；將消毒后的溫度膠囊植入大鼠腹腔，分層縫合關(guān)閉腹腔，消毒手術(shù)部位(圖1)。術(shù)后每日視察傷口情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 術(shù)后恢復(fù)1周后，將大鼠隨機(jī)分為對照組(n=5)與模型組[40℃組(n=5)、41℃組(n=5)、42℃組(n=5)及43℃組(n=5)]。檢測各組大鼠復(fù)制EHS模型前的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。各組大鼠核心體溫、體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.4 EHS模型建立 大鼠實(shí)驗(yàn)前24 h均禁食。實(shí)驗(yàn)艙的環(huán)境溫度設(shè)置為40℃，相對濕度為70%。模型組大鼠同時(shí)放入大鼠跑步機(jī)中，以5 m/min的初速度開始跑步(坡度為0)，速度達(dá)到15 m/min后持續(xù)。大鼠運(yùn)動(dòng)過程中，實(shí)時(shí)檢測各組大鼠核心溫度，達(dá)到預(yù)定溫度時(shí)即認(rèn)為模型建立成功，并記錄跑步時(shí)間和距離。

1.5 凝血相關(guān)指標(biāo) 各組EHS模型大鼠在核心溫度達(dá)標(biāo)時(shí)，檢測凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)、凝血酶敏感蛋白-1(thrombin-sensitive protein-1，TSP-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和血乳酸水平；對照組大鼠在模型組大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前采血并對上述相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測。

圖1 遙測溫度膠囊植入術(shù)

表1 各組大鼠復(fù)制EHS模型前的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

1.6 常規(guī)凝血指標(biāo)測定 使用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)管采集大鼠血液作為檢測樣本，采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀器檢測血小板計(jì)數(shù)；使用枸櫞酸鈉抗凝管(枸鹽酸與血液比例為1∶9)采集大鼠血液作為檢測樣本，室溫下以3 000 r/min離心10 min分離樣本血清，采用全自動(dòng)凝血分析儀檢測PT、APTT、TT、纖維蛋白原；使用肝素化注射器抽取0.5 ml大鼠血液，采用血?dú)夥治鰞x檢測乳酸水平。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血漿TM、vWF、TSP-1和PAI-1水平。取大鼠血漿或標(biāo)準(zhǔn)品100 μl加入反應(yīng)孔，按試劑盒說明書依次完成混勻、溫浴、洗滌、加入抗體、溫浴、顯色等操作步驟，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光值。

2 結(jié)果

2.1 不同核心溫度EHS大鼠狀態(tài) 核心溫度40℃～41℃的大鼠精神狀態(tài)基本正常，呼吸較均勻，口鼻及四肢紅潤，體表出現(xiàn)少量汗液。核心溫度42℃～43℃大鼠精神狀態(tài)萎靡，毛發(fā)悚立、呼吸急促，口鼻出現(xiàn)淡紅色泡沫狀液體，四肢腫脹、紫紺，體表可見大量汗液。核心溫度43℃的大鼠大多數(shù)對任何疼痛刺激無反應(yīng)。隨著運(yùn)動(dòng)距離逐漸增加、運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸延長，EHS大鼠核心溫度呈升高趨勢。40℃組、41℃組、42℃組大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。43℃組大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均長于40℃組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 EHS大鼠運(yùn)動(dòng)距離及時(shí)間比較

2.2 常規(guī)凝血試驗(yàn)指標(biāo)比較 40℃組、41℃組、42℃組、43℃組大鼠的血小板計(jì)數(shù)均較對照組明顯降低，且隨核心溫度升高而明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。41℃組、42℃組、43℃組大鼠的PT、APTT較對照組、40℃組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。43℃組大鼠的TT較對照組、40℃組、41℃組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。42℃組、43℃組大鼠血乳酸水平較對照組、40℃組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40℃組、41℃組大鼠纖維蛋白原水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。42℃組、43℃組大鼠纖維蛋白原水平較40℃組、41℃組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠常規(guī)凝血試驗(yàn)指標(biāo)比較

2.3 凝血分子標(biāo)志物比較 42℃組、43℃組大鼠的TM水平較對照組、40℃組明顯升高，且42℃組大鼠的TM水平較41℃組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40℃組、41℃組、42℃組、43℃組大鼠vWF較對照組明顯升高，且42℃組、43℃組高于40℃組、41℃組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。41℃組、42℃組、43℃組大鼠TSP-1較對照組明顯升高，且43℃組大鼠TSP-1較40℃組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠PAI-1水平隨核心溫度升高呈升高趨勢，其中，對照組、40℃組、41℃組、42℃組大鼠PAI-1水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；43℃組大鼠PAI-1水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠凝血分子標(biāo)志物比較

3 討論

發(fā)生熱射病時(shí)，機(jī)體因熱代謝障礙導(dǎo)致核心體溫升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞在高溫下出現(xiàn)損傷，進(jìn)而激活血小板和凝血因子，引起促凝反應(yīng)[8]；同時(shí)，體液容量減少引起胃腸道損傷，菌群易位導(dǎo)致膿毒癥，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[9]。TM、vWF可反映血管內(nèi)皮損傷程度[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，EHS大鼠在核心溫度40℃時(shí)即出現(xiàn)vWF水平明顯升高，42℃時(shí)出現(xiàn)TM水平明顯升高，這一方面說明EHS大鼠的血管內(nèi)皮損傷程度具有溫度依賴性，另一方面也提示vWF對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的識別早于TM。

TSP-1是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，主要分布在血小板顆粒中，TSP-1水平增高提示血小板分泌增強(qiáng)[12]。熱射病發(fā)生過程中，廣泛內(nèi)皮細(xì)胞損傷可激活血小板，促發(fā)凝血瀑布導(dǎo)致血小板過度消耗；熱射病伴隨的炎癥介質(zhì)釋放也可激活血小板，造成血小板快速減少；此外，熱損傷亦可直接導(dǎo)致血小板破壞[13]。本研究結(jié)果顯示，EHS大鼠在核心溫度40℃時(shí)即出現(xiàn)顯著的血小板減少，提示血小板減少是評價(jià)EHS相關(guān)凝血功能障礙的敏感指標(biāo)。EHS大鼠血小板減少的同時(shí)可出現(xiàn)存活血小板分泌TSP-1等分子的活動(dòng)增強(qiáng)。Wang等[14]將洗滌過的血小板在40℃環(huán)境下培養(yǎng)1 h發(fā)現(xiàn)，高溫下不僅二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集率明顯降低，血小板還可出現(xiàn)線粒體內(nèi)跨膜電位去極化、caspase-3依賴性凝膠蛋白裂解和磷脂酰絲氨酸暴露，進(jìn)而導(dǎo)致血小板凋亡。上述研究與本研究分別從細(xì)胞水平、動(dòng)物整體層次證明高溫對血小板功能的影響，同時(shí)，也都證實(shí)核心溫度40℃是引起EHS相關(guān)血小板功能障礙的重要危險(xiǎn)因素。

PT、APTT和TT依次反映與外源性、內(nèi)源性和共同凝血途徑有關(guān)的凝血因子活性。有研究證實(shí)，熱射病時(shí)PT、APTT延長是患者60 d死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。本研究顯示，核心溫度達(dá)41℃時(shí)，EHS大鼠的PT、APTT明顯延長；核心溫度達(dá)43℃時(shí)，EHS大鼠的TT明顯延長，這說明EHS時(shí)凝血因子活性明顯下降是凝血功能障礙發(fā)展到相對晚期的表現(xiàn)。PAI-1可反映纖溶功能[16]。本研究中，核心溫度43℃時(shí)，PAI-1水平出現(xiàn)顯著升高，提示EHS發(fā)生時(shí)，可出現(xiàn)纖溶異常。既往研究報(bào)道，熱射病時(shí)的PAI-1水平顯著升高可能導(dǎo)致的纖溶抑制狀態(tài)屬于EHS相關(guān)凝血功能障礙的晚期表現(xiàn)[17]。這與本研究PAI-1水平在大鼠核心溫度為43℃才有顯著升高相一致。

血乳酸水平可反映組織微循環(huán)灌注[18]。熱射病時(shí)體液大量丟失，有效循環(huán)血量嚴(yán)重不足造成組織低灌注，臨床可表現(xiàn)為乳酸升高。乳酸升高導(dǎo)致局部酸中毒，可引起微血管麻痹和微血栓形成，加重組織缺血缺氧，進(jìn)一步加重乳酸酸中毒，導(dǎo)致惡性循環(huán)[19]。同時(shí)，腸道缺血缺氧引起繼發(fā)膿毒癥，可加重凝血障礙和組織缺血，加重乳酸酸中毒和休克[20]。核心溫度升高到42℃時(shí)，EHS大鼠出現(xiàn)血乳酸水平明顯升高，說明核心溫度42℃時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重的微循環(huán)障礙，這也是臨床進(jìn)行抗凝治療的適應(yīng)證[21]。

綜上所述，EHS大鼠在核心溫度達(dá)到40℃時(shí)即可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板計(jì)數(shù)減少,核心溫度達(dá)到41℃可出現(xiàn)凝血時(shí)間延長，核心溫度達(dá)到42℃可出現(xiàn)顯著微循環(huán)障礙。不同核心溫度時(shí)EHS大鼠凝血功能障礙的特征既解釋EHS時(shí)凝血功能障礙的機(jī)制，又提示臨床治療EHS相關(guān)凝血功能障礙時(shí)，可參考核心溫度采取相應(yīng)的診療策略。