尿胰蛋白酶抑制劑對(duì)熱射病大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷保護(hù)作用機(jī)制研究

王麗南， 王 宏， 時(shí) 倩， 孫香蕾， 李 楠， 葛 鳳， 金紅旭， 高 燕北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110016

熱射病是由于暴露在熱環(huán)境和/或劇烈運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的機(jī)體產(chǎn)熱與散熱失衡，以核心溫度升高(超過(guò)40℃)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常為主要特征，如意識(shí)障礙、譫妄、抽搐、昏迷等，同時(shí)伴有多器官功能損害且危及生命的臨床綜合征[1]。熱射病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀往往發(fā)病較早、受損較重，即使給予積極降溫等保護(hù)措施，仍有30%左右的患者遺留嚴(yán)重后遺癥[2]。因此，對(duì)熱射病患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)性治療不容忽視。熱休克蛋白70(heatstroke protein 70，HSP70)主要在應(yīng)激條件下表達(dá)，以維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并減少機(jī)體組織損傷[3]。有研究報(bào)道，HSP70在正常腦組織中幾乎不存在，但在熱應(yīng)激、缺血及其他損傷刺激后，腦組織中HSP70的表達(dá)增加，并通過(guò)其分子伴侶、清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等作用對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用[4]。尿胰蛋白酶抑制劑(urinaty trypsin inhibitor，UTI)作為一種廣譜蛋白酶抑制劑，可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生起到抗炎作用。有研究報(bào)道，UTI可通過(guò)減少全身炎癥反應(yīng)，治療重癥胰腺炎、膿毒癥、膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征[5-6]。在呼吸心跳驟停誘導(dǎo)的全腦缺血研究中，UTI可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎癥因子來(lái)減輕腦水腫和炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)功能[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，UTI可能通過(guò)增加HSP70對(duì)燙傷大鼠腦組織起到保護(hù)作用[8]。本研究旨在初步探討UTI對(duì)熱射病大鼠腦組織中HSP70表達(dá)及炎癥因子的影響，分析UTI在熱射病治療中的作用及其可能機(jī)制，尋找可能減少熱射病神經(jīng)系統(tǒng)損傷的有效藥物?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取雄性健康清潔級(jí)SD大鼠30只(由遼寧長(zhǎng)生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量(225±25)g，大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫為(26℃±1℃)，每日采用燈光照明，12 h晝夜節(jié)律變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=10)、熱射病模型組(n=10)與藥物治療組(n=10)。

1.2 試劑與器材 UTI選擇注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：031608143)，HSP70抗體(Proteinch 公司)，鼠抗(美國(guó) abcam 公司)，GAPDH內(nèi)參抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)，HSP70酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物有限公司)，大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司),大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(欣博盛生物有限公司)。人工氣候恒溫箱(寧波東南器械有限公司)，溫度濕度測(cè)量?jī)x(沈陽(yáng)醫(yī)療器械有限公司)，加濕器(奧克斯集團(tuán)有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 模型制備及干預(yù)措施 空白組大鼠置于常溫下。熱射病模型組、藥物治療組大鼠應(yīng)用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，當(dāng)角膜反射與疼痛反射消失且呼吸、心率平穩(wěn)后視為麻醉成功；將麻醉后的大鼠放置于溫度調(diào)至42℃、濕度調(diào)至(60%±5%)的人工氣候箱中[9]，每10 min監(jiān)測(cè)1次肛溫，待肛溫≥42℃時(shí)，視為熱射病模型建立成功[10]。空白組大鼠尾靜脈注射10 ml/kg生理鹽水干預(yù)；熱射病大鼠建模成功后，熱射病模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射10 ml/kg生理鹽水干預(yù)，藥物治療組大鼠經(jīng)尾靜脈給予100 000 U/kg(100 000 U的UTI溶于10 ml生理鹽水)的UTI進(jìn)行干預(yù)。常溫觀察4 h后再次麻醉，予以腹主動(dòng)脈采血，并解剖留取大鼠腦組織。

1.3.2 血清HSP70、IL-1β及TNF-α水平檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)大鼠留取5 ml血液標(biāo)本，以3 000 r/min的速度于離心機(jī)離心10 min后取上清液置于-80℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清HSP70、IL-1β、TNF-α含量，操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，應(yīng)用酶標(biāo)儀讀取相應(yīng)的吸光度值，計(jì)算血清中各檢測(cè)指標(biāo)含量。

1.3.3 檢測(cè)大鼠腦組織HSP70表達(dá) 各組實(shí)驗(yàn)大鼠取適量腦組織，提取組織蛋白，應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。采用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳法分離目的蛋白。待測(cè)樣品經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后予以HSP70一抗(1∶4 000)進(jìn)行室溫下孵育30 min，4℃過(guò)夜。于次日予以鼠二抗(1∶10 000)進(jìn)行孵育2 h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)，應(yīng)用Tanon儀器進(jìn)行曝光，根據(jù)顯影效果決定是否重復(fù)曝光及曝光顯影的時(shí)間。采用Image-proplus軟件分析蛋白條帶平均光密度值。以目的蛋白為內(nèi)參蛋白，平均光密度比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 病理切片制備與觀察 每組取2只實(shí)驗(yàn)大鼠留作病理標(biāo)本，將大鼠麻醉后固定于解剖板上，剪開(kāi)大鼠左側(cè)胸骨旁線，顯露心臟，剪開(kāi)右心耳，夾閉胸主動(dòng)脈，從左心室插入針頭，首先注入生理鹽水約200 ml，至右心耳流出清亮液體為止；再更換4%多聚甲醛約200 ml灌注固定，至大鼠肌肉僵硬為止。留取全腦，置于4%多聚甲醛浸泡固定留作病理切片。取甲醛固定好的腦組織，切取4 mm×3 mm×3 mm的大鼠腦組織塊置于模具內(nèi)。進(jìn)行脫水、透明、侵蠟、包埋，使用組織切片機(jī)切取5 μm切片，置于載玻片上，每只大鼠制作2張病理切片。進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。每張切片觀察5個(gè)視野(400倍高倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù))，計(jì)算每張病理切片神經(jīng)元細(xì)胞存活數(shù)量總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 熱射病大鼠一般狀態(tài)及肛溫變化曲線 熱射病模型組、藥物治療組大鼠置于設(shè)置好的人工氣候箱內(nèi)約10 min后，大鼠表現(xiàn)為精神亢奮，四處攀爬；約20 min后表現(xiàn)為口唇及四肢末端紫紺，心率加快，呼吸深大，躁動(dòng)增加；約30 min后，除上述表現(xiàn)外，出現(xiàn)驚厥，撕咬現(xiàn)象，活動(dòng)逐漸減少，待肛溫接近標(biāo)準(zhǔn)后，大鼠表現(xiàn)為意識(shí)淡漠，精神萎靡。熱應(yīng)激條件下，大鼠肛溫呈持續(xù)直線上升(圖1)。待核心溫度達(dá)到42℃視為熱射病模型建立成功。

圖1 大鼠肛溫變化曲線

2.2 血清HSP70、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較 熱射病模型組血清HSP70、TNF-α、IL-1β水平明顯高于空白對(duì)照組；藥物治療組血清TNF-α、IL-1β水平低于熱射病模型組，血清HSP70水平高于熱射病模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清HSP70、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較

2.3 腦組織HSP70蛋白表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況 熱射病模型組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)少于空白對(duì)照組；藥物治療組大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)量、神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)高于熱射病模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2～3。

3 討論

熱射病根據(jù)發(fā)病因素及易感人群，分為經(jīng)典型熱射病和勞力型熱射病。經(jīng)典型熱射病主要發(fā)生于老年人、兒童、免疫力低下或有基礎(chǔ)疾病的人群，而勞力型熱射病主要發(fā)生于青壯年，如運(yùn)動(dòng)員、軍事訓(xùn)練人員、戶外工作者等[1，11]。流行病學(xué)研究報(bào)道，2006—2010年美國(guó)至少有3 132人死于中暑；2013年7月，英國(guó)在氣溫持續(xù)超過(guò)32℃的幾天內(nèi)約有760人死亡；最為嚴(yán)重的一次為2003年巴黎熱浪，造成1.5萬(wàn)人死亡[12-13]。我國(guó)個(gè)別地區(qū)報(bào)告的熱射病發(fā)病情況顯示，2017年天津市對(duì)7月份中暑患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，死亡人數(shù)為73例[14]。2018年，由于副熱帶高壓異常導(dǎo)致罕見(jiàn)的高溫天氣，東北地區(qū)出現(xiàn)極端天氣，造成熱射病的集中發(fā)生[15]。

表2 腦組織HSP-70蛋白表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況

圖2 熱射病大鼠腦組織HSP70蛋白表達(dá)

圖3 光鏡下大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞圖(HE染色×400；a.空白對(duì)照組；b.熱射病模型組；c.藥物治療組)

對(duì)于熱射病發(fā)病機(jī)制的研究，主要包括體溫調(diào)節(jié)中樞受損、直接熱損傷、全身炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙等[16-17]。以往將熱射病定義為類(lèi)膿毒癥，主要是由于直接熱損傷導(dǎo)致內(nèi)臟血流減少，腸道屏障受損，血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞受損，腸道功能紊亂，黏膜通透性增加，菌群易位，最終引發(fā)全身炎癥反應(yīng)[18]。熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制可能與高熱增加腦組織代謝率，腦血管充血腦組織水腫、顱內(nèi)壓增高，而機(jī)體平均動(dòng)脈壓減低，腦灌注減少，導(dǎo)致血腦屏障受損，通透性增加，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6等大量釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損傷[19-20]。本研究在高溫、高濕環(huán)境下建立熱射病大鼠模型，觀察大鼠行為及意識(shí)狀態(tài)的變化，監(jiān)測(cè)肛溫，并通過(guò)病理切片觀察到熱射病模型組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞損傷較空白對(duì)照組更嚴(yán)重。

熱休克蛋白又稱為熱應(yīng)激蛋白，是各種應(yīng)激誘導(dǎo)下表達(dá)的高度保守蛋白，熱休克蛋白具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用。在急性、慢性應(yīng)激過(guò)程中，由于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，蛋白質(zhì)聚集或調(diào)節(jié)復(fù)合物受損，導(dǎo)致信號(hào)通路激活異常，而熱休克蛋白通過(guò)其分子伴侶作用，使蛋白質(zhì)表達(dá)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到細(xì)胞平衡狀態(tài)[21]。HSP70在正常大腦組織中的表達(dá)水平較低，但對(duì)各種應(yīng)激下神經(jīng)系統(tǒng)起到重要的保護(hù)作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在大腦缺血、損傷模型中，免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞毒性物質(zhì)，而HSP70可減少一氧化氮的產(chǎn)生及誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達(dá)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)的激活，使促炎細(xì)胞因子TNF-α和活性氧分泌減少，同時(shí)，抑制巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子[23-24]。HSP70在腦缺血、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、癲癇和創(chuàng)傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用[25]。有研究報(bào)道，HSP70(+)轉(zhuǎn)基因小鼠的熱耐受性增加，減少熱應(yīng)激引起顱內(nèi)高壓，維持適當(dāng)?shù)钠骄鶆?dòng)脈壓與腦灌注量，防止高熱造成的神經(jīng)元損傷[26]。在熱應(yīng)激前，誘導(dǎo)HSP70超表達(dá)可減少炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、白細(xì)胞介素4等)釋放，而在巨噬細(xì)胞中超表達(dá)的HSP70可阻止脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子釋放[27]。由此可見(jiàn)，HSP70可通過(guò)其抗炎作用對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用。

UTI是一種從人尿液中分離純化的Kuntza型蛋白酶抑制劑，主要抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶等蛋白酶的活性，還能穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶釋放。此外，UTI可減少細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化劑的產(chǎn)生，減少中性粒細(xì)胞蓄積，從而減輕中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷，阻斷炎癥和凋亡通路的激活[28-29]。研究顯示，UTI在大腦缺血-再灌注損傷中，通過(guò)其抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，減少NF-kB的激活，抑制炎癥因子表達(dá)，可改善腦血管的神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分，縮小腦梗死面積，降低腦水腫程度，減少腦組織水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表達(dá)[7,30-31]。在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中發(fā)現(xiàn)，UTI可通過(guò)阻斷c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein Kainse，JNK)、NF-κB、P53的活性，降低腦水腫和微血管通透性，從而達(dá)到抗炎、抗凋亡的作用[32]。多項(xiàng)研究顯示，UTI可通過(guò)調(diào)節(jié)HSP70對(duì)心肌、肺、腎等重要器官起保護(hù)作用[33-34]。本研究結(jié)果顯示，UTI可增加熱射病大鼠HSP70的表達(dá)，同時(shí)，降低IL-1β、TNF-α表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)熱射病大鼠腦組織起保護(hù)作用。

綜上所述，熱射病是熱性相關(guān)疾病中的致命性急癥，尋找創(chuàng)新治療方案將給熱射病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后帶來(lái)不一樣的結(jié)局。UTI可通過(guò)誘導(dǎo)HSP70超表達(dá)，加強(qiáng)抑制炎癥因子的作用，進(jìn)而對(duì)熱射病神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用，但其具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。