坦洋工夫紅茶多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化作用

李達，劉鵬，紀海玉，賈曉昱，田凌

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院，生物工程學院，天津 300451；2.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；3.天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術研究所，天津 300384；4.唐山市盛川農(nóng)產(chǎn)品股份有限公司，河北 唐山 064105）

坦洋工夫紅茶是福建著名的全發(fā)酵茶品，以芽葉為原料，經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等傳統(tǒng)的制茶工藝制作而成[1]，其富含兒茶素、茶黃素和茶紅素等多種抗氧化多酚物質及具有生物活性的碳水化合物等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，機體的衰老主要由氧化損傷導致，表現(xiàn)為學習能力下降、記憶力衰退等明顯特征[4]。紅茶多糖是來源于紅茶的一種重要功能性碳水化合物，因其良好的水溶性而更容易被機體消化吸收[5]。研究表明紅茶多糖具有良好的抗氧化活性[6-9]，但目前關于其生物活性的研究較少。大量的抗衰老研究中建立了D-半乳糖致衰老小鼠模型[10-12]，本實驗也利用D-半乳糖對小鼠進行造模，并觀察記錄模型小鼠的行為學變化，從而研究坦洋工夫紅茶多糖對造模小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶多糖：坦洋工夫紅茶多糖為天津科技大學功能食品實驗室抽提干燥制備，提取劑為75%乙醇溶液、液料比 30∶1（mL/g）、提取溫度 60 ℃、提取時間 70 min，3 500 Da透析袋透析，-80℃冷凍干燥。

實驗動物：ICR 小鼠40只，雄性，體質量（28±2）g，北京大學醫(yī)學部[SCXK（京）2011-0012]。

D-半乳糖：國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸：上海阿拉丁生化科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒及丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒：北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Morris水迷宮：中國醫(yī)學科學院藥物研究所；高速冷凍離心機（5804r）：德國艾本德股份公司；紫外分光光度計（T6新世紀）：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 D-半乳糖致衰老模型的建立

將40只小鼠隨機分為4組，分別為空白對照組[灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水]、模型對照組[灌胃10 mL/（kg·d）生理鹽水]、紅茶多糖低劑量組[500 mg/（kg·d）]、紅茶多糖高劑量組[1 000 mg/（kg·d）]，每組10只。除空白對照組外，每日皮下注射D-半乳糖溶液（125 mg/kg），空白對照組注射等劑量無菌生理鹽水。連續(xù)注射和灌胃6周，每周稱重。

1.3.2 行為學評價

1.3.2.1 水迷宮測試

給藥后5周進行Morris水迷宮測試，訓練期間照常給藥及進食。整個實驗過程分為隱藏平臺獲得實驗和空間搜索實驗兩部分[13-15]。

1.3.2.2 曠場實驗測試

將小鼠置于曠場實驗箱2進行曠場實驗測試，每只觀察5 min，用紅外攝像系統(tǒng)記錄小鼠的運動軌跡，包括，中央格停留時間：即小鼠被放入開闊箱中央格至其三爪跨離該格的時間；直立次數(shù)：兩前爪騰空1 cm以上或攀附墻壁次數(shù)；移動路程:計算5 min內大鼠的移動路程；平均速度:計算大鼠在移動過程中的平均速度；糞便粒數(shù)：實驗結束后，遺留在箱底的糞便數(shù)（每只小鼠實驗完畢取出后，及時清理其排泄物，將開闊箱打掃干凈，以免留有氣味而干擾下一只小鼠的實驗）[16-18]。

1.3.2.3 小鼠主要臟器指數(shù)及血清抗氧化能力測定

造模6周后，在最末次給藥后，禁食12 h。小鼠頸椎脫臼處死，解剖取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腦組織，稱取重量記錄臟器指數(shù)（以g/100 g計），稱重完畢后制備10%組織勻漿，4℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定組織中CAT含量及TAOC、MDA、SOD以及GSH-Px活性。

1.3.2.4 統(tǒng)計學方法

計量資料數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS21.0軟件，進行單因素方差分析，組間采用t檢驗，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 Morris水迷宮實驗結果

記憶力的衰退是衰老的重要生理特征之一，本文采用經(jīng)典行為學測試方法水迷宮實驗[19]，分別在實驗初始階段進行隱藏平臺獲得實驗篩選小鼠，在給藥5周后進行4 d的訓練（隱藏平臺尋找實驗）及一個測試階段（空間搜索實驗），根據(jù)小鼠測試成績對其體現(xiàn)在記憶能力方面的衰老程度進行評價，用以分析探討坦洋工夫紅茶多糖對該模型小鼠衰老程度的影響，結果如圖1所示。

圖1 紅茶多糖對小鼠4天內水迷宮實驗逃避潛伏期的影響Fig.1 Effect of TBTP on escape latency in 4 days of water maze

由圖1可以看出，經(jīng)過4 d的訓練，各組小鼠在第3、4天獲取平臺時間基本穩(wěn)定，說明各組小鼠已經(jīng)基本學會尋找目標平臺。模型對照組獲取平臺時間顯高于其他3組，說明D-半乳糖造模使小鼠的學習及記憶能力都出現(xiàn)了明顯的下降，在第4天，空白對照組和紅茶多糖高劑量組小鼠都表現(xiàn)出了較好的記憶能力，且兩組成績未呈現(xiàn)明顯差異，均優(yōu)于紅茶多糖低劑量組，說明TBTP的抗衰老作用表現(xiàn)出了劑量依賴趨勢。

測試階段的空間搜索實驗結果如表1所示。

表1 紅茶多糖對小鼠水迷宮實驗空間搜索的影響Table 1 Effect of TBTP on water maze performance in aging mice

如表1所示，與空白對照組相比，模型對照組小鼠目標象限停留時間及穿越平臺次數(shù)均有顯著降低，不同劑量TBTP小鼠測試成績均高于模型對照組，且紅茶多糖高劑量組兩項測試結果均顯著高于模型對照組，并與空白對照組未呈現(xiàn)顯著性差異。由此可見，TBTP可以減輕D-半乳糖造成的記憶力減退，甚至增強小鼠的空間記憶能力，且其效果呈現(xiàn)劑量型依賴。

2.2 曠場實驗結果

曠場實驗能夠衡量小鼠的行為學能力[20-22]，實驗結果如表2所示。

表2 紅茶多糖對小鼠曠場實驗的影響Table 2 Effect of TBTP on open-field test in aging mice

與空白對照組比，模型對照組衰老小鼠的移動距離、平均移動速度以及直立次數(shù)均表現(xiàn)出顯著的降低，而停留時間則顯著增加，糞便粒數(shù)減少；與模型對照組比，不同劑量TBTP小鼠的曠場實驗指標均優(yōu)于模型對照組，與紅茶多糖低劑量組相比高劑量組小鼠在移動距離長度有所增加。由此可見，綜合上述兩項結果，從行為學角度出發(fā)，TBTP可以延緩衰老進程，且本實驗呈現(xiàn)出了劑量依賴關系。

2.3 TBTP對小鼠主要臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)可以反映造模劑及實驗用藥對機體的影響，ICR小鼠的臟器指數(shù)如表3所示。

表3 紅茶多糖對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of TBTP on organ index in aging mice g/100 g

由表3可知，D-半乳糖的相對長期（6周）作用，導致小鼠肝、腎指數(shù)的顯著降低，使肝、腎這兩個主要參與代謝的臟器發(fā)生萎縮的現(xiàn)象，而灌胃TBTP可以在一定程度上抑制或緩解這一現(xiàn)象。而本模型小鼠的其他主要臟器，包括心、脾、肺和腦在質量上無明顯變化，TBTP亦不對其產(chǎn)生影響。

2.4 TBTP對小鼠體內抗氧化系統(tǒng)的影響

2.4.1 TBTP對小鼠血清的抗氧化系統(tǒng)的影響

致衰老物質能夠影響血清中的各項指標，從而使機體能力衰退。TBTP對小鼠血清抗氧化系統(tǒng)的主要影響如表4所示。

表4 紅茶多糖對小鼠血清抗氧化指標的影響Table 4 Effect of TBTP on serum antioxidant system indicators in aging mice

TAOC、SOD、CAT、GSH-Px 活力越高則血清抗氧化能力越強。D-半乳糖造模小鼠的血清指標均明顯低于空白對照組，不同劑量TBTP小鼠的測試結果均高于模型對照組，紅茶多糖高劑量組與模型對照組相比各項指標均出現(xiàn)了顯著性提升，并且，TAOC和GSHPx指標與空白對照組相比的均有顯著提升。結果表明，TBTP能夠提升小鼠血清的抗氧化水平且呈現(xiàn)明顯的劑量型關系。

2.4.2 TBTP對小鼠腦組織的抗氧化系統(tǒng)的影響

腦組織中的抗氧化酶種類豐富，TBTP對小鼠腦組織抗氧化系統(tǒng)的影響如表5所示。

表5 紅茶多糖對小鼠腦組織抗氧化指標的影響Table 5 Effect of TBTP on brain antioxidant system indicators in aging mice

TAOC、SOD、GSH-Px活力越高則腦組織的抗氧化能力越強。而過度氧化則會使腦組織中的MDA含量增加。D-半乳糖造模小鼠的TAOC、SOD、GSH-Px均明顯低于空白對照組，不同劑量TBTP小鼠的測試結果均優(yōu)于模型對照組，兩組紅茶多糖與模型對照組相比除MDA活性外各項指標均出現(xiàn)了顯著性提升，且紅茶多糖高劑量組指標更優(yōu)，但是在腦組織中空白對照組各項指標均優(yōu)于其余3組，說明TBTP對于腦組織的抗氧化效果低于血清。

3 結論

研究表明，與模型對照組相比，水迷宮實驗搜臺潛伏期顯著縮短（P＜0.01），空間探索能力明顯增強（P＜0.01），曠場實驗移動路程長度和直立次數(shù)顯著增加（P＜0.01），TBTP顯著的改善了衰老小鼠的學習及記憶能力。并且，TBTP有效提升了衰老模型小鼠的肝、腎指數(shù)，以及提升了血清及腦組織的TAOC、SOD、CAT和GSH-Px活力，并降低了MDA含量，甚至在血清中的TAOC及GSH-Px活力優(yōu)于空白對照組小鼠。綜合表明TBTP有較強的抗氧化活性，能夠有效提升機體的抗氧化能力。