低鹽即食蝦皮氨含量的高效液相色譜分析方法

柳曉萍，郝更新，楊 燊，孫樂常，石林凡，任中陽，邱緒建

(集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021)

0 引言

蝦皮是以中國毛蝦(Aecteschinensis)或日本毛蝦(Acetesjaponicus)為原料經(jīng)干制加工而成的中國傳統(tǒng)特色水產(chǎn)加工制品。蝦皮富含鈣，是深受消費者喜愛的補鈣營養(yǎng)佳品[1]。傳統(tǒng)蝦皮加工通常是采用高濃度鹽水將毛蝦蒸煮曬干或烘干而成，這種產(chǎn)品鹽分含量高、水分含量低，失去了原有的鮮美滋味和營養(yǎng)價值。此外，膳食中鹽食用過多易導致高血壓及患心臟病、腎病及中風的風險增加[2]。近年來，不添加或少量添加食鹽的含水量較高的自動化生產(chǎn)線加工的熟半干低鹽即食蝦皮(含水量可高于35%)，因其鮮度足、口感好而日益受到消費者的青睞。但是，該類蝦皮在冷藏或室溫貯藏過程中隨著時間的延長易產(chǎn)生顯著氨異味，降低了產(chǎn)品的感官品質(zhì)和商業(yè)價值[3-4]。蝦皮貯藏過程中產(chǎn)生的氨物質(zhì)，不僅嚴重影響產(chǎn)品風味，還對人體健康產(chǎn)生不利影響。

揮發(fā)性鹽基氮法是一種常用的分析水產(chǎn)品揮發(fā)性胺類物質(zhì)的方法，但是該方法不能對氨單獨定量。氣相色譜法如果采用火焰離子化檢測器，則無法分析非含碳物質(zhì)；采用質(zhì)譜作為檢測器則因氨分子質(zhì)量小、極易揮發(fā)而導致分析困難。電介質(zhì)阻擋放電離子化檢測器結(jié)合氣相色譜儀器可以實現(xiàn)對氨的分析檢測，但是該檢測器較為少見[5]。此外， 毛細管電泳法也可用來分析海產(chǎn)品中氨的含量，但是不如高效液相色譜儀器那么普及。國內(nèi)外有大量研究報道用丹磺酰氯或苯甲酰氯衍生法分析魚體內(nèi)生物胺含量[6-7]，但是采用此方法分析氨的研究較為少見[8-9]，目前尚沒有應(yīng)用此方法在蝦皮中分析氨的報道。蝦皮中氨物質(zhì)含量可對產(chǎn)品感官品質(zhì)有重要影響，因此，探究一種可以分析氨含量的方法很有必要。本研究旨在研究一種可以分析蝦皮中氨含量的高效液相色譜方法，該方法建立在生物胺分析方法的基礎(chǔ)上，利用丹磺酰氯柱前衍生然后用HPLC分析。而且，此方法可以同時分析生物胺類物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LXJ-IIB型離心機,上海安亭科學儀器廠；AR1530型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;液相色譜儀，美國Waters公司；KQ-500型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；粉碎機，德國IKA集團。

氯化胺、二甲胺、色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺及1,7-二氨基庚烷(純度>98%)均購自上海麥克林生化科技有限公司。甲苯、三氯乙酸、碳酸鈉等購自國藥集團化學試劑有限公司。色譜純乙腈購自默克公司。實驗用水為超純水，由Millipore Simplicity 制備。低鹽蝦皮購自集美農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

蝦皮經(jīng)粉碎機粉碎后，取2 g 樣品置于離心管內(nèi)，然后加入0.5 mL 5 g/L內(nèi)標物質(zhì)1,7-二氨基庚烷及15 mL冰的質(zhì)量分數(shù)為5%三氯乙酸溶液，混合后振蕩并超聲5 min，4 000 r/min離心5 min。取上清液放置于25 mL容量瓶中，剩余濾渣加入8 mL冰的質(zhì)量分數(shù)為5% 三氯乙酸溶液，再次振蕩超生離心后，將上清液移入之前的25 mL容量瓶中，并用質(zhì)量分數(shù)為5% 三氯乙酸溶液定容。取1 mL該溶液置于1.5 mL離心管中，15 000 r/min離心5 min，再取100 μL進行衍生化處理。

1.2.2 樣品衍生化

將上述處理的衍生試樣與200 μL飽和Na2CO3溶液和400 μL的10 g/L丹磺酰氯(丙酮配制)混合以進行衍生化。使用振蕩器將整個混合物混合均勻，在60 ℃水浴鍋內(nèi)保溫5 min。最后加入100 μLL-脯氨酸溶液終止反應(yīng)，室溫避光存放15 min。加入500 μL甲苯振蕩，取300 μL上層有機溶液，氮氣吹干后加入1 mL乙腈，過0.22 μm濾膜后進行HPLC分析。HPLC色譜分析條件：色譜柱為Alltima C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) ；柱溫為 35 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；檢測波長為254 nm。流動相及梯度洗脫程序見表1。1.2.3 標準曲線繪制將0.1 mL 0.000 5～0.2 g/L 的系列濃度的氨溶液按照1.2.2步驟進行衍生化處理后上機分析，以峰面積為縱坐標，以氨濃度為橫坐標繪制外標標準曲線。含0.1 g/L 內(nèi)標1,7-二氨基庚烷的氨系列標準溶液也按同樣方法衍生化并上機分析，以氨與內(nèi)標的峰面積之比為縱坐標，以氨濃度為橫坐標繪制內(nèi)標標準曲線。

表1 樣品HPLC梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program for HPLC samplest/minΦ(水Water)/%Φ(乙腈Acetonitrile)/%04555336645326892476111585131387150100174555254555

1.2.4 精密度及穩(wěn)定性實驗

將標品溶液0.1 g/L衍生化后連續(xù)進樣測定精密度，同一樣品在3 d 進行相同方法分析，計算比較分析結(jié)果。

1.2.5 加標回收率實驗

在樣品中按低、中、高3個添加量進行加標回收率實驗，分別平行測定3次，在扣除本底蝦皮氨含量后，按外標法和內(nèi)標法分別計算回收率。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理及衍生化方法的確定

在水產(chǎn)樣品生物胺分析過程中，三氯乙酸或高氯酸是最常用的去除蛋白質(zhì)并提取胺類物質(zhì)的溶劑。研究表明[10]，三氯乙酸的凈化效果要優(yōu)于高氯酸，且高氯酸為危險化學品管控試劑。因此，本實驗采用三氯乙酸作為樣品前處理的試劑。

氨或生物胺因為沒有特征的光譜吸收基團，因此需要衍生化處理，衍生化試劑一般為丹磺酰氯或苯甲酰氯。但有研究報道[11]，苯甲酰氯衍生化過程中可能形成雜質(zhì)峰而干擾分析，因此，本實驗選用較為常用的丹磺酰氯作為柱前衍生劑。

文獻中關(guān)于丹磺酰氯衍生化的溫度(25～60 ℃)和時間(5～60 min)都有差異[12-13]。本實驗采用60 ℃對加熱5，15，30 min的樣品溶液峰面積進行比較，發(fā)現(xiàn)峰面積沒有隨時間延長而增加，說明5 min 加熱時間已經(jīng)達到較優(yōu)的衍生化效果。因此，采用5 min 作為加熱時間(見圖1)。目前生物胺分析方法較多，很多提取衍生步驟繁瑣而且不統(tǒng)一，這可能與樣品種類、分析目的等有關(guān)。本實驗采用的衍生化方法較為簡便，洗脫溶劑不含鹽類物質(zhì)，分析結(jié)果表明，本方法可以使10種胺類物質(zhì)實現(xiàn)良好分離，峰形較好，無拖尾現(xiàn)象(見圖2)。

2.2 標準曲線、精密度及穩(wěn)定性實驗

外標標準曲線和內(nèi)標標準曲線在一個相對較寬的范圍內(nèi)都有很好的線性關(guān)系，R2值均大于0.99(見表2)。內(nèi)標法分析圖譜見圖3。按照3倍信噪比計算，樣品的檢測限約為0.7 mg/L。通過外標法和內(nèi)標法計算得到的樣品值均相對穩(wěn)定，但是外標法得到的含量明顯偏低。衍生后溶液連續(xù)進樣后的峰面積相差不大，相對標準偏差為0.79%，說明儀器系統(tǒng)分析穩(wěn)定可靠。衍生化的標液貯藏在4 ℃、48 h內(nèi)峰面積變化不大，相對標準偏差為0.45%。對同一冷凍樣品在3 d分別按內(nèi)標法處理分析，樣品氨含量基本保持穩(wěn)定(見圖4)。

表2 低鹽即食蝦皮中氨加標回收率不同定量方法的比較(n=3)

2.3 回收率實驗

外標法計算得到的回收率在55%～71%，遠低于內(nèi)標法計算得到的回收率(見表2)。內(nèi)標法可以部分消除提取衍生等步驟過程中的分析目標物的損失，因此，本實驗氨的分析宜采用內(nèi)標法。

3 結(jié)論

本實驗應(yīng)用丹磺酰氯柱前衍生法來分析低鹽蝦皮氨物質(zhì)含量,并分析了其可行性。結(jié)果表明，氨標準液在0.000 5～0.2 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，精密度和穩(wěn)定性良好，內(nèi)標法定量分析較外標法有更高的回收率。該方法亦可同時分析樣品中可能存在的生物胺如組胺、腐胺等。