腦肌酸激酶/磷酸肌酸系統(tǒng)與中樞認(rèn)知功能的機(jī)制綜述

張涵濤，朱 朱，李瑞梅，徐淑怡，陳飛燕，戴建國，陳 琳，趙玉男

南京中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023

肌酸激酶(creatine kinase，CK)又稱肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶，是由兩個相同的或極其相近的亞基組成的二聚體酶，包括肌肉型、腦型、雜化型和線粒體型同工酶。CK主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，是一種與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)再生有直接關(guān)系的重要激酶，其與磷酸肌酸(creatine phosphate，PCr)形成了能量緩沖系統(tǒng)。大腦中的CK/PCr系統(tǒng)主要包括兩種CK同工酶——胞質(zhì)腦型CK(brain-type creatine kinase，B-CK)和普遍存在的線粒體CK(ubiquitous mitochondrial creatine kinase，uMtCK)[1]。神經(jīng)系統(tǒng)所需要的大部分能量也是由線粒體以ATP的形式提供，腦CK/PCr能量緩沖系統(tǒng)在神經(jīng)細(xì)胞復(fù)雜的代謝和能量轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用。認(rèn)知功能是大腦的主要功能之一，受腦內(nèi)微環(huán)境、神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量和結(jié)構(gòu)、突觸形態(tài)、腦內(nèi)能量水平等因素影響[2]。認(rèn)知功能障礙常伴有腦能量代謝的紊亂，提示腦CK/PCr系統(tǒng)的異?？赡芘c認(rèn)知功能障礙有著密切的聯(lián)系。本文對近年來相關(guān)的研究進(jìn)行綜述，以闡明腦CK/PCr系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能障礙的病理生理機(jī)制，并為以肌酸(creatine，Cr)或CK為靶點開發(fā)新藥提供一定的參考。

1 肌酸激酶/磷酸肌酸能量緩沖系統(tǒng)

CK與PCr形成一個重要的能量緩沖系統(tǒng)(圖1)：該系統(tǒng)參與轉(zhuǎn)運高能磷酸化合物，把 ATP 從產(chǎn)能區(qū)運至需能區(qū)，發(fā)揮空間上的緩沖作用；同時，在能量需求高或波動較大的細(xì)胞充當(dāng)能量池，發(fā)揮時間上的緩沖作用；此外，CK的存在使 PCr 的高能磷?；芸焖俎D(zhuǎn)移到二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)生成ATP，加快ATP的生成速度，增加了能量釋放的爆發(fā)力，維持一個相對較高的ATP/ADP比例，使細(xì)胞在機(jī)體有高能量需求時仍能發(fā)揮正常功能[3-4]。

圖1 腦肌酸激酶/磷酸肌酸能量緩沖系統(tǒng)[4]

在腦中，B-CK和uMtCK都有特定的功能。uMtCK利用線粒體內(nèi)ATP，將其高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移至Cr，形成PCr輸出到胞質(zhì)。在高能量需求時，B-CK利用胞質(zhì)PCr的能量儲備，將ADP轉(zhuǎn)化為ATP供能；而在需求降低時，B-CK又將多余的ATP轉(zhuǎn)化為PCr進(jìn)行儲能，并且在這個過程中多余的Cr也被重新輸送回線粒體，在uMtCK的作用下重新轉(zhuǎn)化為PCr[5]。

2 肌酸對認(rèn)知功能的影響

Cr參與細(xì)胞能量的傳遞、運輸和調(diào)節(jié)，并且以非依賴氧氣的方式補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的ATP[6]。近年來大量研究顯示，Cr增補(bǔ)可提高運動員對高強(qiáng)度運動的適應(yīng)力并促進(jìn)運動損傷的恢復(fù)[7–9]。鑒于Cr在缺氧致神經(jīng)元損傷時仍具有神經(jīng)保護(hù)作用以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高代謝需求特性，通過Cr增補(bǔ)改善認(rèn)知功能已成為研究熱點之一。

2.1 肌酸缺乏與認(rèn)知功能障礙 在脊椎動物中，Cr可通過飲食和內(nèi)源性合成獲得，進(jìn)入血液循環(huán)后被高能量需求的靶組織吸收[10]。相比于其他組織器官，腦組織中Cr的合成和攝取更為復(fù)雜，可分為以下四種不同細(xì)胞亞群[11]：1)含有Cr合成途徑的兩種酶，甘氨酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(arginineglycine aminidino transferase，AGAT)和胍基乙酸甲基轉(zhuǎn)移酶(guanidinoacetate methyl transferase，GAMT)；2)只有AGAT或GAMT，需要Cr轉(zhuǎn)運體(creatine transporter，CrT) SLC6A8協(xié)助；3)不含有任何合成酶，并且絕對依賴于CrT來吸收其他細(xì)胞產(chǎn)生的Cr；4)沒有任何合成酶或轉(zhuǎn)運體，也不使用Cr。

AGAT和GAMT缺乏癥患者因腦Cr合成障礙、腦內(nèi)Cr水平降低，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、智力遲鈍和語言障礙等認(rèn)知功能損傷，且GAMT缺乏癥患者的臨床表現(xiàn)較AGAT缺乏者更加嚴(yán)重，這是由于缺乏GAMT會增加神經(jīng)毒醋酸胍的積累[12-13]。

CrT起著將Cr從血液循環(huán)分配到組織中的作用，CrT的突變使細(xì)胞攝取Cr的能力喪失[14]。Hautman等[15]發(fā)現(xiàn)CrT+/-雌性小鼠的腦Cr水平降低，在Morris水迷宮實驗中，登臺潛伏期和尋找隱藏平臺時間延長，提示CrT+/-雌性小鼠存在一定的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷；Baroncelli等[16]發(fā)現(xiàn)在新物體識別實驗中，腦特異性CrT基因敲除的雄性小鼠對熟悉物體的記憶能力下降，并隨年齡增加而逐漸加重。臨床研究也發(fā)現(xiàn)CrT缺乏癥患者存在注意力減退、語言功能損傷等認(rèn)知功能障礙的臨床表現(xiàn)[17]。CrT功能受損導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能如下：腦內(nèi)Cr水平明顯降低，使海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白數(shù)量顯著減少，且打破γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和Tau蛋白的穩(wěn)態(tài)，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力受損和認(rèn)知功能障礙[18-20]。

2.2 肌酸增補(bǔ)與認(rèn)知功能改善 Turner等[6]發(fā)現(xiàn)通過補(bǔ)充Cr增加神經(jīng)系統(tǒng)Cr的水平，可提高缺氧時促腎上腺皮質(zhì)激素的興奮性，緩解嚴(yán)重缺氧引起注意力下降的程度。此外，絕經(jīng)后的女性補(bǔ)充Cr可以改善其認(rèn)知功能[20]。Shen和Goldberg[21]發(fā)現(xiàn)體外補(bǔ)充Cr可延緩低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元膜的去極化，有利于維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整性。Mao等[22]研究顯示，補(bǔ)充Cr可以激活mTORC1信號(mTORC1信號通路在學(xué)習(xí)記憶的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用)和增加齒狀回突觸后蛋白PSD-95，進(jìn)一步改善大鼠脂多糖誘導(dǎo)的空間記憶和識別記憶障礙。

大量研究顯示，補(bǔ)充Cr對神經(jīng)退行性疾病有一定的改善作用。1)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)：Brewer和Wallimann[23]發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)的神經(jīng)元中，補(bǔ)充Cr可減輕谷氨酸及β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積對海馬神經(jīng)元的毒性，其中谷氨酸積累和Aβ沉積會嚴(yán)重影響認(rèn)知功能。在AD模型小鼠中，補(bǔ)充Cr增加了環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化(在學(xué)習(xí)和記憶過程中起著重要作用[24])并提高了NF-κB抑制劑(NF-κB與學(xué)習(xí)記憶和突觸功能密切相關(guān))、CaMKⅡ(長期記憶形成所需的蛋白質(zhì))和PSD-95的表達(dá)水平，并減少了Aβ的沉積；在行為學(xué)上，補(bǔ)充Cr后小鼠水迷宮實驗中，登臺潛伏期明顯縮短，提示補(bǔ)充Cr可以改善小鼠空間記憶能力[4]。2)亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)：HD是一種全外顯性的常染色體顯性遺傳病，其致病基因Huntingtin表達(dá)Huntingtin蛋白致神經(jīng)退行性病變，主要表現(xiàn)在運動性神經(jīng)元的病變，其次是認(rèn)知障礙。補(bǔ)充Cr給予細(xì)胞能量支持，改善神經(jīng)元的形態(tài)和功能，為治療HD提供可行性方案[25]。3)抑郁癥：Pazini等[26]發(fā)現(xiàn)Cr增補(bǔ)可以逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮抑郁模型小鼠的海馬背側(cè)區(qū)和腹側(cè)區(qū)神經(jīng)元分化異常，并在一定程度上改善小鼠的情緒和認(rèn)知功能。4)多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)：MS以脫髓鞘、突觸病變和神經(jīng)變性為特征[27]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病普遍存在著認(rèn)知功能受損[28]。有研究顯示在脫髓鞘疾病中，增加髓鞘的再形成，可以明顯改善小鼠的空間記憶能力，而補(bǔ)充Cr有助于增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體功能并促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活，從而促進(jìn)MS的髓鞘再形成，就這暗示了補(bǔ)充Cr治療MS的可行性[29-30]。

3 肌酸激酶對認(rèn)知功能的影響

在野生型小鼠的大腦中，B-CK在海馬、皮質(zhì)層深處、小腦顆粒細(xì)胞層中有較高的表達(dá)水平。早在20世紀(jì)60年代有研究發(fā)現(xiàn)uMtCK通常與B-CK共表達(dá)，這兩種CK亞型均高表達(dá)于小腦顆粒層細(xì)胞、脈絡(luò)膜叢、海馬顆粒和錐體細(xì)胞中[31]。神經(jīng)元需要大量ATP來維持膜的極化、細(xì)胞器中的Ca2+內(nèi)流、神經(jīng)遞質(zhì)的加工、細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng)的運行、軸突和樹突運輸，B-CK和uMtCK與這些重要過程密切相關(guān)。在亞細(xì)胞水平上，B-CK還與突觸囊泡和突觸質(zhì)膜結(jié)構(gòu)功能的維持有關(guān)。

Jost等[32]發(fā)現(xiàn)B-CK基因敲除的小鼠在海馬苔蘚纖維連接的形成和維持，以及習(xí)慣化、空間學(xué)習(xí)和癲癇易感性等行為方面表現(xiàn)出明顯異常，揭示了B-CK在認(rèn)知功能中的重要作用；Streijger等[33]對缺乏B-CK和uMtCK基因表達(dá)的成年小鼠(CK雙敲除小鼠)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CK雙敲除小鼠大腦質(zhì)量減少和海馬體積縮小，行為學(xué)分析顯示該種小鼠空間學(xué)習(xí)能力嚴(yán)重受損，并表現(xiàn)出較低的筑巢活動和聲震反射反應(yīng)，這些結(jié)果表明缺乏B-CK和(或)uMtCK，降低了成年小鼠大腦的突觸回路應(yīng)對認(rèn)知活動相關(guān)挑戰(zhàn)的效率。Briones等[34]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷患者B-CK水平降低，而絕大多數(shù)創(chuàng)傷性腦損傷患者存在著認(rèn)知功能障礙。另外，uMtCK與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子協(xié)同調(diào)節(jié)海馬的學(xué)習(xí)記憶功能，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在突觸可塑性維持過程中發(fā)揮重要作用，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[35-36]。以上研究都直接或間接提示了缺乏B-CK和(或)uMtCK可能會影響認(rèn)知功能。

4 肌酸激酶與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元和(或)其髓鞘的喪失所致，以行為、運動和認(rèn)知功能障礙為主要特征。B-CK活性降低是神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元損傷的標(biāo)志之一。以下是幾種伴有CK異常的神經(jīng)退行性疾病。

4.1 阿爾茨海默病 蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，B-CK是AD腦內(nèi)特異性氧化蛋白之一，AD患者腦組織中B-CK的活性明顯降低，意味著AD患者腦中穩(wěn)定的細(xì)胞能量狀態(tài)受到干擾，膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和突觸的能量供應(yīng)也會發(fā)生改變[37]。Hernández等[38]發(fā)現(xiàn)Tau蛋白與B-CK結(jié)合可以穩(wěn)定腦能量代謝，在軸突運輸過程中起著關(guān)鍵作用，而AD患者的腦內(nèi)B-CK被氧化，Tau蛋白無法與B-CK結(jié)合，從而使AD患者腦內(nèi)神經(jīng)功能受損，學(xué)習(xí)記憶相關(guān)認(rèn)知功能出現(xiàn)障礙。Fahanik-Babaei等[39]發(fā)現(xiàn)給予AD模型大鼠葫蘆巴堿可以減輕海馬CA1區(qū)域的神經(jīng)元死亡、改變氧化應(yīng)激相關(guān)反應(yīng)、改善空間記憶和物體識別等相關(guān)認(rèn)知功能。Farid等[40]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)B-CK是葫蘆巴堿的直接結(jié)合靶點，葫蘆巴堿可以穿透血腦屏障進(jìn)入大腦，結(jié)合并激活B-CK，從而促進(jìn)神經(jīng)元軸突和樹突的生長，改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能，反之使用B-CK抑制劑會拮抗葫蘆巴堿誘導(dǎo)的軸突和樹突的生長。

4.2 亨廷頓舞蹈病 GABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中斷被認(rèn)為參與了HD發(fā)病的過程，GABA能神經(jīng)元的功能在很大程度上取決于跨膜氯化物的濃度梯度，其主要受Na+-K+-2Cl-聯(lián)合轉(zhuǎn)運體和氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2的控制，而Na+-K+-2Cl-聯(lián)合轉(zhuǎn)運體和氯化鉀協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2的活性受到B-CK的調(diào)控[41]。Ju等[42]發(fā)現(xiàn)能量失調(diào)是HD的一個重要致病因素，包括B-CK在內(nèi)的三個關(guān)鍵分子與HD發(fā)病過程密切相關(guān)。Lin等[43]發(fā)現(xiàn)突變的Huntingtin基因抑制了B-CK基因啟動子的功能，使得HD小鼠腦內(nèi)B-CK表達(dá)水平顯著降低，引起神經(jīng)突起萎縮等病理改變，從而導(dǎo)致與HD相關(guān)的神經(jīng)元功能障礙，而內(nèi)源性增加B-CK的表達(dá)或膳食補(bǔ)充Cr可明顯逆轉(zhuǎn)上述病變，這提示了B-CK在HD發(fā)病過程中的重要地位。

4.3 多發(fā)性硬化癥 認(rèn)知障礙是MS患者最常見的癥狀之一，可發(fā)生在疾病的任何一個階段[44]。MS患者體內(nèi)B-CK水平降低，導(dǎo)致了大腦白質(zhì)中的PCr代謝障礙，使谷氨酸毒性增加，一方面腦白質(zhì)與認(rèn)知功能密切相關(guān)，另一方面谷氨酸毒性積累會導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和軸突退化，進(jìn)一步影響認(rèn)知功能[45-46]。Shen等[47]發(fā)現(xiàn)B-CK具有維持信號快速轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，還發(fā)現(xiàn)了B-CK與髓鞘蛋白同時表達(dá)，表明B-CK可能與髓鞘化有著某種聯(lián)系。Wang等[48]發(fā)現(xiàn) 2-( 2-苯并呋喃?；?2-咪唑啉在大腦中大量表達(dá)，與B-CK結(jié)合具有較高的特異性，使用2-( 2-苯并呋喃酰基)2-咪唑啉治療MS模型小鼠，可以增強(qiáng)B-CK和CaATP酶的活性并降低鈣蛋白酶的活性，以保護(hù)損傷的神經(jīng)元。

4.4 其他神經(jīng)退行性疾病 在皮克病[49]、雷特綜合征[50]、彌漫性路易體疾病[51]和雙相情感障礙[52]等其他神經(jīng)退行性疾病中，B-CK的活性和(或)含量均存在不同程度的降低。Xu等[53]發(fā)現(xiàn)PD患者體內(nèi)uMtCK水平顯著降低，uMtCK活性與帕金森綜合征的進(jìn)展過程呈正相關(guān)。

在上述神經(jīng)退行性疾病中，CK活性和(或)含量的變化均有不同程度的下降，其引起認(rèn)知功能障礙的機(jī)制主要涉及對神經(jīng)元樹突和軸突的形態(tài)、突觸的可塑性、細(xì)胞內(nèi)信號系統(tǒng)的運行、神經(jīng)纖維髓鞘化、氧化應(yīng)激反應(yīng)和谷氨酸的積累的影響，藥物激活CK或內(nèi)源性增加CK可以明顯改善動物的認(rèn)知功能，這提示以CK為靶點探索改善認(rèn)知功能障礙藥物的可行性，為藥物研發(fā)提供了新的思路。

5 腦型肌酸激酶和線粒體肌酸激酶的區(qū)別和聯(lián)系

Lenz等[54]用si-RNA沉默細(xì)胞內(nèi)B-CK和uMtCK基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比于沉默B-CK基因，沉默uMtCK基因后線粒體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，這一研究證實了uMtCK在維持內(nèi)膜的ATP- ADP偶合交換和穩(wěn)定線粒體內(nèi)外膜方面的具體作用，提示了uMtCK不僅參與了能量緩沖系統(tǒng)，還保護(hù)了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。

有研究對B-CK-/-、uMtCK-/-和雙敲除的CK-/-小鼠進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，腦PCr水平在B-CK-/-或uMtCK-/-小鼠中無顯著變化，而在CK-/-小鼠中明顯降低，提示B-CK和uMtCK在PCr代謝上的協(xié)同效應(yīng)[55]。此外，與野生型相比，uMtCK-/-小鼠有較高的谷氨酸水平，B-CK-/-小鼠的總N-乙酰天冬氨酸(NAA)和肌醇水平較低，這提示 uMtCK對認(rèn)知功能的影響可能與促進(jìn)谷氨酸的清除有關(guān)，而B-CK的作用可能與維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)/功能完整性、抗神經(jīng)炎癥有關(guān)[56-58]。

Meyer等[57]發(fā)現(xiàn)uMtCK可以減少丙酮酸氧化，減少活性氧的形成，且發(fā)現(xiàn)Cr有抗氧化的作用，但Cr抗氧化作用的發(fā)揮是需要激活uMtCK介導(dǎo)的，當(dāng)uMtCK功能缺失時，胞質(zhì)型CK可以補(bǔ)償這種缺失，以確保維持Cr磷酸化和ADP的產(chǎn)生。這提示uMtCK可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，但在神經(jīng)退行性疾病中檢測B-CK水平可能更加有意義。

B-CK和uMtCK在大腦的分布和對認(rèn)知功能影響的機(jī)制上有許多共同之處，也有一定的區(qū)別。見表1。

表1 腦內(nèi)腦型肌酸激酶和線粒體肌酸激酶的區(qū)別和聯(lián)系

6 結(jié)語

大量研究提示腦CK/PCr系統(tǒng)對認(rèn)知功能有明顯影響，其機(jī)制主要涉及線粒體功能和細(xì)胞能量代謝，而且B-CK和uMtCK可能存在某種協(xié)同效應(yīng)。相比而言，B-CK在保持神經(jīng)元軸突和樹突的正常形態(tài)、維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整性上發(fā)揮著更重要的作用，而uMtCK可能更偏向于影響線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

隨著社會的高速發(fā)展與人口老齡化的加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率居高不下，越來越多的老年人面臨認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險，因此，尋找能有效預(yù)防或治療認(rèn)知功能障礙的藥物迫在眉睫。既往大量研究表明CK/PCr能量緩沖系統(tǒng)的激活與認(rèn)知功能障礙的改善密切相關(guān)，這豐富了對認(rèn)知功能障礙病理生理機(jī)制的認(rèn)識，也提示以Cr或CK為靶點探索改善認(rèn)知功能障礙藥物的可行性，為藥物研發(fā)提供新的思路。