Tuftsin衍生物T肽的抗腫瘤作用及機(jī)制探討

史振偉，羅 東，孫 琦，王聰聰，楊 齊，馬 玥，楊 飛，黃轉(zhuǎn)青，徐風(fēng)華

1 解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心 藥劑科藥學(xué)基礎(chǔ)研究室，北京 100853；2 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853

黑色素瘤是一類起源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，發(fā)生于皮膚、黏膜、眼葡萄膜、軟腦膜等部位[1]。它是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，具有高度惡性、高侵襲性、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的特點(diǎn)。盡管我國黑色素瘤的發(fā)病率較歐美國家低[2]，但近年來呈現(xiàn)快速增長的趨勢，加之我國人口基數(shù)大，因此我國黑色素瘤患者的數(shù)量龐大[3-4]。近年來，新的有效系統(tǒng)診治方案的發(fā)展[5]，尤其是通過改善自身免疫系統(tǒng)自然防御機(jī)制的免疫治療的發(fā)展使患者的存活率大幅提高，抗腫瘤免疫治療日益受到人們的重視[6-8]。促吞噬肽(Tuftsin)是源于脾的活性四肽[9]，是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。Tuftsin可以激活粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，通過提高它們的趨化性、吞噬作用以及增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用[10-12]，從而增強(qiáng)淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞免疫活性，并表現(xiàn)出抗腫瘤作用[9,13-14]。但它在體內(nèi)易被酶解，半衰期短，僅16 min，限制了其成藥性[15]。為了增加促吞噬肽的穩(wěn)定性并延長其在體內(nèi)的生物活性時(shí)間，人們開發(fā)了各種衍生物[15-17]。T肽是以Tuftsin為母體進(jìn)行改造所得到的一種新型衍生物[18]，其由4個(gè)Tufsin經(jīng)賴氨酸連接而成，分子量在2 000以上。這種連接結(jié)構(gòu)使T肽在體內(nèi)更穩(wěn)定，半衰期延長為2～4 h[18-19]。初步研究表明，T肽在一定條件下表現(xiàn)出可靠且顯著的腫瘤抑制作用。在裸鼠移植瘤模型中，T肽能夠顯著抑制HepG2人肝癌、HT29人結(jié)腸癌和BGC-823人胃腺癌術(shù)后腫瘤生長，發(fā)揮抗腫瘤作用，抑制率可達(dá)60%以上[20]；在非免疫缺陷小鼠移植瘤模型中，T肽對術(shù)后腫瘤的生長抑制率高達(dá)70%以上。同時(shí)，在抗腫瘤研究中，T肽表現(xiàn)出良好的安全性，對小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響[21]。此外，An等[20]發(fā)現(xiàn)T肽可以與巨噬細(xì)胞中表達(dá)的特異性表面抗體結(jié)合，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和細(xì)胞毒功能。根據(jù)這些結(jié)果，我們推測T肽對腫瘤的治療作用主要源于免疫系統(tǒng)的激活，但具體有哪些免疫細(xì)胞和免疫因子被激活尚不完全清楚。在本研究中，我們嘗試通過對T肽的體內(nèi)外抗腫瘤活性研究和對免疫系統(tǒng)的激活作用研究，進(jìn)一步探討T肽的抗腫瘤作用機(jī)制。

材料與方法

1 儀器和試劑 流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司，型號CytoFLEX)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Millipore公司，型號Scepter2.0)；移液器(德國Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo型號HERAcell240i)；培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)；T肽為白色凍干粉末，純度大于98%，由解放軍總醫(yī)院藥學(xué)基礎(chǔ)研究室提供，批號：120903；APC/Cyanine7 anti-mouse CD3流式檢測抗體、FITC anti-mouse CD4流式檢測抗體、Per-CP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a流 式 檢 測 抗 體、PE/Cy7 anti-mouse/human CD44流式檢測抗體、APC anti-mouse NK-1.1流式檢測抗體、PE antimouse CD86流式檢測抗體、Brilliant Violet 421TManti-mouse CD206 (MMR)流式檢測抗體、Brilliant Violet 650TManti-mouse F4/80流式檢測抗體、Brilliant Violet 605TManti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)流式檢測抗體、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X破膜液)、PE/DazzleTM594 antimouse/human CD11b流式檢測抗體(美國Biolegend公司)；IL-2 Elisa試劑盒、IL-4 Elisa試劑盒、IL-10 Elisa試劑盒、IL-12 Elisa試劑盒、TNF-α Elisa試劑盒、IFN-γ Elisa試劑盒、TGF-β Elisa試劑盒(美國Biolegend公司)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)。

2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物 B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存提供。C57BL/6小鼠12只，鼠齡6周左右，體質(zhì)量(16.58±0.58) g，健康雌性，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司并飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。試驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)福利倫理委員會批準(zhǔn)，授權(quán)編號為2019-X15-90。

3 B16-F10細(xì)胞移植性腫瘤模型的建立和分組處理 12只小鼠隨機(jī)分為兩組，即T肽組和對照組，每組6只。兩組小鼠右側(cè)前肢腋下接種黑色素瘤細(xì)胞懸液0.1 mL，含B16-F10細(xì)胞5×105個(gè)。腫瘤細(xì)胞接種后當(dāng)天(第0天)T肽組小鼠皮下注射T肽(藥物劑量8 mg/kg)，實(shí)驗(yàn)期間隔日給藥，共計(jì)給藥9次；對照組小鼠注射相同體積的0.9%氯化鈉注射液。待腫瘤生長至可見突起后隔日測量腫瘤的長短徑。

腫瘤體積按公式計(jì)算：V=L×W2/2(V=腫瘤體積，L=長徑，W=短徑)。

腫瘤生長抑制率(瘤重)=(空白對照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對照組瘤重×100%。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾組織免疫細(xì)胞表達(dá) 在第17天處死小鼠，每組隨機(jī)取5只小鼠，無菌操作取小鼠脾，用眼科剪將脾剪碎成小塊，把脾放在網(wǎng)上，以5 mL注射器內(nèi)芯輕輕搓組織塊，邊搓邊加0.9%氯化鈉注射液沖洗，直至完成，離心去上清；加入紅細(xì)胞裂解液3 mL，室溫放置5 min，離心去上清；用2 mL含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。取5×106個(gè)細(xì)胞置于24孔板內(nèi)，并加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液至2 mL，培養(yǎng)72 h。收集細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，離心后收集上清液，用于檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β、IFN-γ的分泌量；另取含5×106個(gè)細(xì)胞的懸液置于流式檢測管，每管加入適量(200 μL)的預(yù)稀釋好的CD3、CD4、CD8、CD44、NK1.1、F4/80、CD86、CD11b、Gr-1流式檢測抗體；在空白管或同型對照管中加入與實(shí)驗(yàn)組相同量的抗體對照試劑；各管避光在4℃冰箱中孵育30 min；加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液，然后350 g離心5 min后棄上清液；每管內(nèi)加入0.5 mL固定液，室溫、避光孵育20 min；離心棄去上清液；加入配制好的破膜液，離心后棄去上清液，重復(fù)1次。在每個(gè)流式檢測管中加入適量(200 μL)的預(yù)稀釋的CD206流式檢測抗體，室溫、避光孵育20 min；加入1 mL破膜液，350 g離心5 min后棄上清。用500 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，過200目細(xì)胞篩，上機(jī)檢測免疫細(xì)胞的數(shù)量。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠移植瘤免疫細(xì)胞表達(dá) 在第17天處死小鼠，每組隨機(jī)取5只小鼠，用眼科剪取小鼠移植瘤，并將腫瘤組織剪碎成小塊，小心研磨，用200目篩網(wǎng)濾取細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，離心去上清；加入紅細(xì)胞裂解液3 mL，室溫放置5 min，離心去上清；用2 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。取含5×106個(gè)細(xì)胞的懸液置于流式檢測管，每管加入適量(200 μL)的預(yù)稀釋好的CD3、CD4、CD8、CD44、NK1.1、F4/80、CD86、CD11b、Gr-1流式檢測抗體；在空白管或同型對照管中加入與實(shí)驗(yàn)組相同量的抗體對照試劑；各管避光在4℃冰箱中孵育30 min；加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液，然后350 g離心5 min后棄上清液；每管內(nèi)加入0.5 mL固定液，室溫、避光孵育20 min；離心棄去上清液；加入配制好的破膜液，離心后棄去上清液，重復(fù)1次。在每個(gè)流式檢測管中加入適量(200 μL)的預(yù)稀釋的CD206流式檢測抗體，室溫、避光孵育20 min；加入1 mL破膜液，350 g離心5 min后棄上清。用500 μL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，過200目細(xì)胞篩，上機(jī)檢測免疫細(xì)胞的數(shù)量。

6 小鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中免疫因子表達(dá)量測定 摘取小鼠眼球取血，收集血液于離心管內(nèi)，在冰塊上靜置2 h，2 000 r/min離心10 min，收集上層血清,采用ELISA法測定血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中免疫因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β、IFN-γ的表達(dá)量。

7 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶，收集細(xì)胞并用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，備用。將B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞以10 000/孔的密度接種在96孔板中。培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，使細(xì)胞在T肽濃度為0.1、1、5、10 μmol/L的培養(yǎng)基以及PBS(對照組)中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。按照說明書操作，使用CCK-8測定細(xì)胞活性，在450 nm測定吸光值A(chǔ)，使用公式計(jì)算存活百分比：

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)分析軟件和SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T肽對移植腫瘤生長的抑制作用 兩組小鼠在接種腫瘤細(xì)胞前體質(zhì)量無明顯差異；在實(shí)驗(yàn)期間，兩組小鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量無明顯差異(圖1A)，T肽組小鼠移植瘤腫瘤體積和重量明顯低于對照組，移植腫瘤抑制率約為56.45%(圖1D)。

圖1 T肽抑制體內(nèi)B16-F10腫瘤生長作用Fig.1 T peptide inhibits B16-F10 tumor growth in vivo

2 T肽對小鼠脾組織免疫細(xì)胞表達(dá)量的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾組織免疫細(xì)胞表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)T肽可顯著升高荷黑色素瘤小鼠脾組織中CD8+T淋巴細(xì)胞(圖2A)、記憶性T細(xì)胞(CD3+CD44+)(圖2B)、髓系來源抑制細(xì)胞(CD11b+Gr-1+)(圖2D)和M1巨噬細(xì)胞(F4/80+CD86+)(圖2E)表達(dá)率，而對CD4+T淋巴細(xì)胞(圖2A)、自然殺傷細(xì)胞(NK1.1+)(圖2C)、M2巨噬細(xì)胞(F4/80+CD206+)(圖2F)表達(dá)率無明顯影響。

圖2 小鼠脾中各免疫細(xì)胞(流式代表圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果)Fig.2 FCM assay of splenocytes from tumor-bearing mice

3 T肽對移植瘤免疫細(xì)胞表達(dá)量的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，皮下隔日注射T肽可顯著升高黑色素瘤小鼠腫瘤組織中記憶性T細(xì)胞(CD3+CD44+)(圖3A)表達(dá)率，而對CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞(圖3B)、自然殺傷細(xì)胞(NK1.1+)(圖3C)、髓系抑制細(xì)胞(CD11b+Gr-1+)(圖3D)、M1巨噬細(xì)胞(F4/80+CD86+)(圖3E)、M2巨噬細(xì)胞(F4/80+CD206+)(圖3F)表達(dá)率無明顯影響。

圖3 小鼠腫瘤組織各免疫細(xì)胞(流式代表圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果)Fig.3 FCM assay of immune cells infiltrating into tumors

4 T肽對小鼠血清和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中免疫因子表達(dá)的影響 ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，T肽組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中IFN-γ(圖4G)分泌量顯著高于對照組，而IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β分泌量與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4A～圖4F)，提示T肽能提高細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)量。

圖4 T肽對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中細(xì)胞因子的影響(aP＜0.05；bP＜0.01)Fig.4 Effect of T Peptide on cytokines produced in the cultured supernatant of splenocytes and in serum (aP＜0.05；bP＜0.01)

5 T肽對細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8法測定B16-F10黑色素瘤細(xì)胞與不同濃度的T肽孵育72 h后的細(xì)胞活力。結(jié)果表明，T肽在0.1～10 μmol/L范圍內(nèi)均不影響B(tài)16-F10細(xì)胞的增殖，亦未顯示對腫瘤細(xì)胞的濃度依賴性作用。見圖5。

圖5 不同濃度T肽對體外腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of T peptides at different concerntrations on melanoma cells in vitro

討 論

本研究表明，T肽在體外對腫瘤細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，其體內(nèi)抗腫瘤作用主要是由于免疫系統(tǒng)激活。荷瘤小鼠給予T肽后，CD8+T細(xì)胞、CD3+CD44+T細(xì)胞、MDSCs和M1巨噬細(xì)胞在脾中聚集的比例增加，IFN-γ表達(dá)增加。巨噬細(xì)胞在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，腫瘤基質(zhì)中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控下改變其表型，進(jìn)化為抑制腫瘤生長的M1型或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的M2型。本研究發(fā)現(xiàn)T肽組小鼠脾中M1型巨噬細(xì)胞(F4/80+CD86+)的表達(dá)率升高，而M2型巨噬細(xì)胞(F4/80+CD206+)的表達(dá)率無明顯變化，說明T肽有利于腫瘤抑制性巨噬細(xì)胞(M1)的產(chǎn)生，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類似[20]。這些發(fā)現(xiàn)部分解釋了T肽對皮下移植瘤的抑制作用。

An等[20]報(bào)道T肽在鼠源性肉瘤細(xì)胞S180和肝癌細(xì)胞H22小鼠移植瘤模型中未顯著抑制腫瘤生長，認(rèn)為T肽不會抑制體內(nèi)腫瘤生長，本研究中T肽對B16-F10黑色素移植瘤的抗腫瘤作用顯著，導(dǎo)致不同結(jié)果的原因可能是T肽給藥時(shí)間不同。An等[20]的研究中，當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到80 ～100 mm3時(shí)小鼠皮下注射T肽，本研究中自小鼠皮下接種細(xì)胞懸液當(dāng)日即開始給予T肽，這進(jìn)一步說明T肽是通過調(diào)動機(jī)體免疫力發(fā)揮抗腫瘤作用的，當(dāng)外來腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)定植并形成瘤體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)已受到影響，導(dǎo)致T肽的作用下降，不能表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的作用。

髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被認(rèn)為是免疫抑制網(wǎng)絡(luò)的主要組成部分，在諸多病理?xiàng)l件下干擾T細(xì)胞功能，這些細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖和B細(xì)胞的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，T肽治療組脾組織細(xì)胞中CD11b+Gr-1+的表達(dá)率升高，提示T肽對MDSCs的表達(dá)和分布也有調(diào)節(jié)作用，相關(guān)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

綜上，T肽可通過增加小鼠脾中CD8+T細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞的水平，并增加免疫因子IFN-γ的表達(dá)來抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞移植性腫瘤的生長，全面理解其腫瘤抑制作用機(jī)制還有待于更加全面系統(tǒng)的研究。