烷烴為底物合成槐糖脂發(fā)酵過程供氧控制優(yōu)化

劉 暢， 陳 陽， 田錫煒， 莊英萍， 儲 炬， 王澤建

（ 華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室, 生物工程學院，上海 200237）

槐糖脂（Sophorolipids, SLs）是最具應(yīng)用潛力的生物表面活性劑之一，具有高生物降解、低毒等特性，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、制藥和石油工業(yè)中[1]。Candida bombicola（C.bombicola）是目前研究最為廣泛的槐糖脂生產(chǎn)菌株[2]?；碧侵蔷哂卸喾N結(jié)構(gòu)的混合物，由親水的槐糖和含有16～18 個碳原子的疏水羥基脂肪酸按物質(zhì)的量之比1∶1 組成[3]，可以分為酸型和內(nèi)酯型兩種[4]，其中乙?；头且阴；?、羥基脂肪酸鏈長度、脂肪酸不飽和度等因素對槐糖脂的結(jié)構(gòu)和性能有所影響[5-9]。目前，因為化學方法生產(chǎn)的表面活性劑會帶來一系列嚴重的生態(tài)問題[10-11]，因而利用微生物源生產(chǎn)槐糖脂等表面活性劑的方法得到迅速發(fā)展，并從不同方面進行優(yōu)化實現(xiàn)了槐糖脂的高效合成[12-14]。

葡萄糖、乳清、大豆糖蜜等可以作為槐糖脂合成的親水性底物，而油脂、脂肪酸、烷烴等可以作為其合成的疏水性底物[15-16]。石油烴是石油的主要成分，其中大量的烷烴會對環(huán)境造成持續(xù)性污染[17]，并嚴重危害人類健康[18]。正十六烷是常見的石油烴污染源，目前主要以物理法、化學法和生物法修復石油污染[19]。由于生物法具有綠色無污染、成本低等優(yōu)點，因此，通過菌株利用烷烴合成槐糖脂，能夠有效實現(xiàn)烷烴的降解，同時獲得特定性能的槐糖脂產(chǎn)物。

槐糖脂合成是一個高耗氧的過程，氧氣主要用于葡萄糖分解代謝、疏水性底物分解代謝和槐糖脂合成代謝。Guilmanov 等[20]通過對分批發(fā)酵合成槐糖脂過程中氧傳質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)當氧傳質(zhì)速率在50～80 mmol/(L·h)時，槐糖脂產(chǎn)率最高，達到1～1.5 g/(L·h)。滕麗麗[21]通過基因工程手段提高菌株對氧氣的親和力，雖然在低供氧條件下提高了槐糖脂的產(chǎn)量，但在正常供氧條件下對槐糖脂產(chǎn)量的提高影響有限，表明槐糖脂的合成與胞內(nèi)的多種因素有關(guān)。文獻[22-23]認為在槐糖脂合成過程中，疏水性底物羥基化的P450 單加氧酶是主要限速步驟[22-23]，而且葡萄糖和疏水性底物的氧化往往需要消耗大量的氧氣以產(chǎn)生能量，因此探究不同供氧水平下槐糖脂生產(chǎn)菌株胞內(nèi)代謝通量分布對深入認識細胞的氧代謝特性，優(yōu)化發(fā)酵過程溶氧控制策略具有重要意義。

本文以正十六烷作為疏水性底物合成C16槐糖脂，并通過調(diào)節(jié)不同生產(chǎn)階段的供氧水平，從宏觀代謝差異結(jié)合胞內(nèi)代謝通量和關(guān)鍵酶活性差異的整合分析，深入考察氧代謝對槐糖脂合成的影響，從而實現(xiàn)最適供氧水平下的槐糖脂發(fā)酵。

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株及來源 假絲酵母菌C.bombicolaATCC 22 214 購于廣州市菌株保藏中心，菌株在甘油質(zhì)量分數(shù)為20%的甘油管中保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

（1）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 50，KH2PO41，(NH4)2SO44，MgSO4·7H2O 0.5，玉米漿 10。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，KH2PO41，(NH4)2SO44，MgSO4·7H2O 0.5，玉米漿 10。培養(yǎng)基經(jīng)過115 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)在1 L 的擋板搖瓶中進行，加入200 mL培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速和溫度分別為200 r/min 和25 ℃的搖床中培養(yǎng)48 h。

槐糖脂培養(yǎng)在5 L 的發(fā)酵罐中進行，初始體積為2.5 L，接種量為2.9%（體積分數(shù)），OD600為80。發(fā)酵溫度為25 ℃，通氣量為0.5 vvm，初始轉(zhuǎn)速為300 r/min。培養(yǎng)過程中用4 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為3.5。正十六烷通過補料泵添加到培養(yǎng)基中，每24 h添加1次固體葡萄糖，使葡萄糖質(zhì)量濃度維持在30～80 g/L。發(fā)酵過程中前24 h 的轉(zhuǎn)速控制在300 r/min，以維持菌體生長；高供氧組、低供氧組和優(yōu)化組的轉(zhuǎn)速分別控制在350、 280、 320 r/min，以實現(xiàn)不同的供氧水平。

1.3 分析方法

1.3.1 正十六烷含量測定 發(fā)酵液中正十六烷的含量使用氣相色譜法檢測[24]。首先，取3個平行樣品（2 mL 發(fā)酵液）并添加相同體積的正己烷，振蕩離心，萃取兩遍，取上清用氣相色譜儀檢測。檢測條件如下：進樣口溫度300 ℃，空氣流量400 mL/min，氫氣流量30 mL/min，尾吹氣流量25 mL/min，分流比13.846∶1，分流流量90 mL/min。升溫程序為初始150 ℃保持2 min；以40 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持3 min；以20 ℃/min 的速率升溫至280 ℃，保持8 min。

1.3.2 槐糖脂產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)測定 槐糖脂產(chǎn)量采用高效液相色譜法檢測，2 mL 發(fā)酵液與等體積的氫氧化鉀/甲醇溶液（cKOH=4 mol/L）混合均勻，80 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫后，用甲醇和NaH2PO4緩沖液（0.2 mmol/L）定容至10 mL，將樣品稀釋到適當濃度進行高效液相色譜分析。流動相為：甲酸0.1%（體積分數(shù)），甲酸銨20 mmol/L，甲醇75%（體積分數(shù)），C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm, Acchrom），示差折光檢測器（RID），流速0.9 mL/min，進樣體積20 μL，柱溫50 ℃，檢測溫度35 ℃。利用乙酸乙酯萃取正十六烷發(fā)酵液中的槐糖脂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的槐糖脂固體用于檢測槐糖脂的抗菌性、表面張力和乳化性等?；碧侵靡掖既芙夂蟛捎酶咝б合嗌V-質(zhì)譜法檢測其結(jié)構(gòu)，檢測方法與Chen 等[25]描述的方法一致。

1.3.3 葡萄糖和生物量測定 葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀（SBA-40C，山東省科學院）進行檢測。將萃取過槐糖脂的下層發(fā)酵液用乙醇溶液（乙醇與水的體積比1∶1）洗滌兩遍，在4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心2 min。然后，在80 ℃烘箱中烘干，稱取菌體干重（DCW）。

1.3.4C.bombicola中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 槐糖脂合成過程中胞內(nèi)中心的碳代謝通量采用化學計量學方法進行計算，其前提假設(shè)是胞內(nèi)代謝物濃度守恒，即代謝物的利用速率和生成速率在數(shù)值上是相等的。通過分析代謝通量可以得到胞內(nèi)代謝通量分布圖，從而展示每一個代謝反應(yīng)的流量值以及代謝通量的整體分布狀況。建立假絲酵母合成槐糖脂的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，擬耦合以下途徑：糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)途徑、糖異生途徑、脂肪酸從頭合成途徑、脂肪酸β-氧化途徑、烷烴氧化途徑和槐糖脂合成途徑。假設(shè)槐糖脂合成階段胞內(nèi)中間代謝物都處于擬穩(wěn)態(tài)，考慮代謝網(wǎng)絡(luò)中碳總量平衡。胞外檢測氧氣、葡萄糖和烷烴的消耗速率，槐糖脂和二氧化碳的生成速率，以及副產(chǎn)物乳酸、琥珀酸、丙酮酸和檸檬酸的生成速率。代謝網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)化合物對照表、代謝通量反應(yīng)方程式分別見表1 和表2。

表1 代謝網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)代謝物對照表Table 1 Comparison table of related compounds in metabolic network

表2 代謝通量方程式Table 2 Metabolic flux equation

續(xù)表2

1.3.5 關(guān)鍵酶活性測定 （1）P450 單加氧酶[26]：通過一定量的P450 單加氧酶催化正十六烷轉(zhuǎn)化成正十六醇，以其間煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的消耗量來定義酶活。添加150 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），再添加20 μL 1 mmol/L 的NADPH 溶液，20 μL 3 mg/L 的底物正十六烷，最后添加10 μL破碎酶系，30 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢在340 nm 處測量并讀取吸光度值。

（2）脂肪醇氧化酶（FAO）[27]：利用醇氧化酶將正十六醇氧化生成正十六醛，催化反應(yīng)如下: R-OH +O2→ RO + H2O2，在含有2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）以及過氧化物酶的緩沖體系中發(fā)生顏色反應(yīng)，使體系中的液體由無色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{綠色，在加入含有酶以及相應(yīng)的長鏈脂肪醇溶液后，測定405 nm 處的吸光度值，定量測定醇氧化酶的活性。將2 mL pH 7.0 的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液、0.8 mL 3 mmol/L的ABTS 溶液、60 μL 的過氧化物酶和40 μL的粗提酶液混合，分別加入到兩個比色皿中，將其中一個比色皿中的混合液作參比，向另一個比色皿中加入100 μL 底物（1.5 mmol/L 正十六醇乙醇溶液），記錄405 nm 處吸光度值的變化。

1.3.6 氧攝取速率（OUR）、二氧化碳釋放速率（CER）的檢測 發(fā)酵尾氣中氧氣和二氧化碳含量采用尾氣過程質(zhì)譜儀（MAX300-LG，美國Extrel 公司）進行檢測，CER、OUR 及其比值RQ分別通過公式（1）、（2）和公式（3）計算[28]。

式中，F(xiàn)in表示進氣流量（mmol/L），V表示發(fā)酵液初始體積（L），cinert,in表示進氣中惰性氣體的濃度（mmol/L），cO2,in，cO2,out表示尾氣中氧氣的濃度（mmol/L），cCO2,in，cCO2,out表示尾氣中二氧化碳的濃度（mmol/L），Tin表示進氣溫度，pin表示進氣壓力，h代表尾氣濕度。OUR和CER 的單位為mmol/(L·h)。

文中槐糖脂產(chǎn)量、葡萄糖消耗量和烷烴消耗量均已進行標準化處理（以初始體積計）。所有實驗重復3 次，圖和表中數(shù)據(jù)均為3 次實驗的平均值。采用Origin 8.0 和SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同供氧水平下以烷烴為底物合成槐糖脂的發(fā)酵過程參數(shù)變化

圖1 示出了不同供氧水平下以烷烴為底物合成槐糖脂的發(fā)酵過程的參數(shù)變化。如圖1（a）所示，在發(fā)酵進行到24 h 時通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速（n）降低供氧水平，使OUR 降低為高供氧組的1/2（OUR 約為24 mmol/(L·h)）。由于此時細胞已經(jīng)進入穩(wěn)定期，因此供氧水平的調(diào)節(jié)對最大生物量沒有顯著影響，高供氧組和低供氧組兩個組別下的最大細胞干重均為18 g/L 左右（圖1（b））。相比之下，供氧水平對槐糖脂合成則影響較大，在低供氧條件下，槐糖脂產(chǎn)量只有55.0 g/L，比高供氧條件下降低了30.5%（圖1(c)）。此外，從發(fā)酵過程主要指標參數(shù)的比較結(jié)果來看（表3），雖然低供氧組的槐糖脂比總底物消耗得率（YSLs/substrate）和比葡萄糖消耗得率（YSLs/Glc)分別比高供氧組的相應(yīng)值降低了15.9%和33.8%，但是其槐糖脂比烷烴得率(YSLs/Alk)卻比高供氧組提高了37.3%，這表明在低供氧條件下，細胞對于烷烴底物的利用更有經(jīng)濟性，而且更多地依賴于葡萄糖底物用于維持代謝和合成代謝所需能量的供應(yīng)。值得注意的是，通過在線檢測CER 和RQ的變化也能夠很好地反映出細胞代謝途徑的改變，雖然發(fā)酵進行到24 h 時低供養(yǎng)組的OUR 水平降低為高供氧組的一半，但是CER 值卻只降低到高供氧組大約62.6%的水平，相對應(yīng)的RQ值也開始表現(xiàn)出明顯的差異（圖1(d)），高供氧組和低供氧組在槐糖脂生產(chǎn)期的RQ值基本穩(wěn)定在0.56 和0.74。通過理論計算可知，當葡萄糖完全氧化時，RQ值為1；當十六烷烴完全氧化時，RQ值為0.65。由于槐糖脂合成途徑也是耗氧步驟，因此，這在一定程度上表明低供氧組有更多葡萄糖被完全氧化用于能量合成，RQ值有望作為一個潛在的細胞代謝表征參數(shù)用于槐糖脂合成過程的進一步優(yōu)化。

表3 不同供氧水平下發(fā)酵過程關(guān)鍵參數(shù)比較Table 3 Comparison of key parameters under different oxygen supply levels during the fermentation process

圖1 以烷烴為底物合成槐糖脂的發(fā)酵過程參數(shù)變化Fig. 1 Parameter changes of sophorolipids synthesis using alkanes as substrates during the fermentation process

2.2 不同供氧水平下胞內(nèi)代謝通量和關(guān)鍵酶活性分析

針對不同供氧條件下細胞對不同底物的利用水平差異，建立了槐糖脂合成階段（72～96 h）代謝網(wǎng)絡(luò)模型（圖2），其中高供氧組和低供氧組的碳回收率分別約為100.9%和95.1%（表4），因此，可以通過圖2利用化學計量法計算槐糖脂合成過程中胞內(nèi)各物質(zhì)的代謝流量。如圖2所示，在槐糖脂合成菌株中主要有3 條關(guān)鍵代謝途徑：葡萄糖分解代謝途徑、脂肪酸β氧化代謝途徑和槐糖脂合成途徑。其中葡萄糖參與磷酸戊糖途徑和分解氧化途徑分別提供NADPH和胞內(nèi)維持能；而脂肪酸參與β氧化代謝途徑主要提供槐糖脂合成的乙酰輔酶A 和胞內(nèi)維持能。

圖2 不同供氧條件下槐糖脂發(fā)酵過程的代謝網(wǎng)絡(luò)模型（上下數(shù)據(jù)分別為高供氧組和低供氧組的代謝通量）Fig. 2 Metabolic network model of sophorolipids fermentation process under different oxygen conditions (The upper and lower data represent the metabolic flux of the high oxygen group and the low oxygen group, respectively)

首先，在低供氧條件下，細胞攝取烷烴的量降低了57.6%（表4），主要原因是供氧受限，P450 單加氧酶和長鏈FAO 的平均酶活分別降低了71.1%和74.5%（圖3），從而使烷烴氧化成為槐糖脂合成的主要限速步驟。其次，低供氧組中槐糖脂合成受限導致對胞內(nèi)NADPH和乙酰輔酶A 的需求量降低，從而使脂肪酸參與β氧化途徑的比例降低了13.6%，參與槐糖脂合成途徑的比例提高。同樣地，葡萄糖參與磷酸戊糖途徑的比例也降低了55.5%，其更多地進入糖酵解過程以提供細胞維持能。相比之下，在高供氧水平下，槐糖脂合成需要更多的NADPH 和乙酰輔酶A，使烷烴流向β氧化途徑的比例提高，不僅生成更多的乙酰輔酶A，而且也提供大量的細胞維持能。此外，葡萄糖主要參與槐糖脂的合成途徑及磷酸戊糖途徑以提供前體和NADPH。最后，在不同供氧水平下胞內(nèi)烷烴和葡萄糖參與分解氧化和槐糖脂合成途徑的比例不同，表現(xiàn)在宏觀RQ值上也會有所差異。因此，RQ可以作為一個胞內(nèi)代謝表征的參數(shù)用于在線監(jiān)測槐糖脂合成過程中胞內(nèi)物質(zhì)分配以及發(fā)酵過程中供氧的適配性。槐糖脂合成是胞內(nèi)能量、NADPH、乙酰輔酶A 和氧氣供給等多種因素共同影響的結(jié)果，通過基因工程手段簡單地提高或限制某一基因可能難以提高槐糖脂產(chǎn)量[29]。從代謝物網(wǎng)絡(luò)模型可知，提高槐糖脂合成可以通過以下幾個方面共同調(diào)控：（1）提高磷酸戊糖的通量從而提高胞內(nèi)NADPH 供給；（2）提高P450 單加氧酶的酶活以提升整個槐糖脂合成的速率；（3）強化檸檬酸裂解酶的活性（強化檸檬酸轉(zhuǎn)運體系）以提高槐糖脂合成乙酰輔酶A 的供給等[5,30-31]。

圖3 不同供氧條件下槐糖脂發(fā)酵過程關(guān)鍵酶活Fig. 3 Key enzyme activities in the sophorolipids fermentation process under different oxygen conditions

表4 不同供氧水平下菌株72～96 h 的比速率和碳回收率Table 4 Specific rate and carbon recovery rate of strains under different oxygen levels at 72-96 h

2.3 槐糖脂發(fā)酵過程供氧策略優(yōu)化

通過階段性調(diào)整槐糖脂發(fā)酵過程的攪拌速度，能夠?qū)崿F(xiàn)不同的供氧水平（圖4(a)）。隨著攪拌速度逐漸上升，槐糖脂發(fā)酵過程中OUR 不斷增加，但RQ值表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，與上述代謝網(wǎng)絡(luò)模型分析結(jié)果一致。此外，從槐糖脂產(chǎn)率（圖4(b)）可以看出，當OUR 小于45 mmol/(L·h)（即發(fā)酵時間85～95 h）時，槐糖脂產(chǎn)率顯著降低，表明此時細胞受到供氧水平的限制；而OUR 達到45 mmol/(L·h)之后，槐糖脂產(chǎn)率基本保持在1.14 g/(L·h)左右，說明此時可能存在其他的限制因素導致產(chǎn)率無法進一步提高。從RQ值變化（圖4（a））上可以看出，即使產(chǎn)率不變時，RQ仍進一步降低，表明疏水和親水底物的利用效率依舊會隨著改變，葡萄糖主要合成槐糖脂，而烷烴參與胞內(nèi)維持能的供給比例提高。因此，在后續(xù)研究中將OUR 維持在45 mmol/(L·h)左右，此時RQ值為0.62（圖5）。比較表5 和表3 可知，優(yōu)化后槐糖脂最終產(chǎn)量達到83.8 g/L，整個發(fā)酵過程平均產(chǎn)率為0.87 g/(L·h)，較優(yōu)化前高供氧組分別提高了5.9%和4.8%。而且與優(yōu)化前高供氧組相比，優(yōu)化組的葡萄糖底物利用率雖然略微下降，但是烷烴利用率上升，因此與相對廉價的葡萄糖消耗相比，優(yōu)化組更具有生產(chǎn)經(jīng)濟性。此外，優(yōu)化組轉(zhuǎn)速（320 r/min）較高供氧組轉(zhuǎn)速（350 r/min）降低了8.6%，因此在一定程度上降低了功率輸入，從而減少了能耗。

圖4 槐糖脂發(fā)酵過程階段性調(diào)整Fig. 4 Phase adjustment of sophorolipids fermentation process

圖5 優(yōu)化后槐糖脂發(fā)酵參數(shù)Fig. 5 Sophorolipids fermentation parameters after optimization

表5 優(yōu)化后發(fā)酵過程關(guān)鍵指標參數(shù)Table 5 Key parameters of fermentation process after optimization

3 結(jié) 論

（1）研究了不同供氧條件下烷烴合成槐糖脂的代謝差異，并通過代謝通量計算和關(guān)鍵酶活性分析，發(fā)現(xiàn)氧氣供給對細胞脂肪酸和羥基脂肪酸的合成具有重要影響，從而造成細胞對于葡萄糖和烷烴利用率的差異，在線參數(shù)RQ值能夠很好地反映這一變化，后續(xù)可以把RQ作為重要的過程調(diào)控參數(shù)來進一步優(yōu)化槐糖脂發(fā)酵過程。

（2）在合成期提供最適的供氧水平，能夠有效提高底物利用的經(jīng)濟性，并且減少功率輸入，從而降低能耗。