電針干預(yù)對(duì)大鼠脊髓損傷后miR-124-3p及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響*

楊春悅，唐 云，許建文

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

脊髓損傷（spinal cord injury,SCI）是全球最常見的死亡和殘疾的原因之一，會(huì)導(dǎo)致主要的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和自主神經(jīng)功能障礙[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)目前SCI的患者例數(shù)為291 000例，根據(jù)SCI發(fā)生的年齡，其終生成本高達(dá)每人1.1～500萬(wàn)美元[2]。不良的預(yù)后和致殘率給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。SCI病理生理學(xué)機(jī)制可分為兩個(gè)階段：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷可導(dǎo)致神經(jīng)實(shí)質(zhì)、神經(jīng)膠質(zhì)的破壞和其他細(xì)胞的死亡；繼發(fā)性損傷[3]是指基于原發(fā)性損傷后進(jìn)一步的化學(xué)和機(jī)械損傷，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、軸突再生、髓鞘形成、細(xì)胞增殖等一系列過(guò)程，是處于細(xì)胞分子水平上的主動(dòng)調(diào)控過(guò)程，具有可逆性。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，電針治療能夠顯著促進(jìn)SCI后的神經(jīng)功能的再生和運(yùn)動(dòng)功能的康復(fù)[4]。

微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）是一類片段長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA[5]，作為轉(zhuǎn)錄后的一種調(diào)節(jié)劑，通過(guò)靶基因來(lái)參與生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控[6]。miR-124-3p作為miRNAs的一員，近年來(lái)在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中被廣泛研究[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-124-3p能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡并促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)[8]。然而miR-124-3p在SCI中的作用機(jī)制未能完全闡明。本研究通過(guò)建立大鼠SCI模型，探究miR-124-3p的表達(dá)水平及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，擬為電針治療SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)提出可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，重量210 g左右，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（桂）：2020-0003。分籠飼養(yǎng)，食物和水按時(shí)攝入。使用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組20只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定。

1.2 主要儀器及試劑

華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號(hào)：0.25 mm×25 mm）；華佗牌脈沖針灸治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號(hào)：SDZ-Ⅱ）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)：Pac300）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)：StepOnePlusTM Real-Time Instrument）；Odyssey CLx型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)Li-Cor公司）；病理圖像分析儀（德國(guó)LEICA，型號(hào)：DMR+Q550）；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）兔源一抗（武漢Proteintech公司）；二抗羊抗兔lgG（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 動(dòng)物造模

采用改良型Allen’s打擊法構(gòu)建SCI模型[9]，具體方法如下：將SD大鼠以10%戊巴比妥腹腔注射，誘導(dǎo)時(shí)間約10 min，以T10為中心，消毒、鋪巾，取后正中線切口3 cm左右，層層剝離出T9～T11的棘突和椎板，用咬骨鉗咬除T10段的胸椎棘突和椎板，并使用打擊裝置垂直下落撞擊T10段中心位置脊髓，打擊高度5 cm，打擊重量10 g，當(dāng)損傷節(jié)段出現(xiàn)出血、水腫、大鼠尾巴痙攣性搖擺、雙下肢和軀體抽動(dòng)時(shí)，即為造模成功。假手術(shù)組僅暴露脊髓，無(wú)需打擊。術(shù)后注意保暖和干燥，連續(xù)3 d予以各組大鼠腹腔青霉素注射液預(yù)防感染，膀胱按摩促進(jìn)排尿。

1.4 各組處理方法

穴位參照第十版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行定位。電針組于術(shù)后6 h開始電針干預(yù)，選取T9～T11段夾脊穴、大椎穴、雙側(cè)下肢足三里穴進(jìn)行針刺，針刺深度約2 mm，得氣后連接電針儀，選擇頻率1 Hz，電流1 mA的疏密波，治療時(shí)間為30 min，1次/d，連續(xù)7 d。假手術(shù)和模型組予以相同固定處理和喂養(yǎng)條件，不做治療。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估 各模型組大鼠于術(shù)后第1、第3、第7天采取雙盲法進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，評(píng)分參照Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）[10]量表：最小值為0分，表示后肢各關(guān)節(jié)無(wú)活動(dòng)，最大值為21分，表示后肢運(yùn)動(dòng)功能完全正常。

1.5.2脊髓組織病理檢測(cè) 術(shù)后第7天采用心臟灌注法對(duì)各組大鼠進(jìn)行取材。將提取的損傷節(jié)段脊髓組織（約1 cm），使用4%多聚甲醛固定、脫水、包埋、切片，進(jìn)行蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在病理圖像分析儀下觀察并拍照。

1.5.3 Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

從-80℃冰箱中取出損傷節(jié)段脊髓組織，剪碎后使用低溫快速研磨機(jī)研磨組織，離心，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，煮沸變性。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后切取目的條帶轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗Bcl-2、Bax（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，羊抗兔IgG熒光二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，使用美國(guó)Li-Cor Odysse Clx雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.4 RT-qPCR法檢測(cè)miR-124-3p的表達(dá)水平

取大鼠損傷節(jié)段脊髓組織，使用Nucleo ZOL法提取總RNA，紫外分光光度儀分析測(cè)定RNA純度和濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取適量RNA配置反應(yīng)體系。miR-124-3p以U6作為內(nèi)參，上游引物序列：5’-GGAACGATACAGA-GAAGATTAGC-3’，下游引物序列：5’-TGGAACG-CTTCACGAATTTGCG-3’。miR-124-3p引物序列為：5’-GAAGGCACGCGGTGAATG-3’，采用2-△△CT法計(jì)算miR-124-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，若計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布或方差齊性，多組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術(shù)后第1、第3、第7天后肢BBB評(píng)分比較

假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組術(shù)后第1、第3、第7天的BBB評(píng)分均降低，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；電針組術(shù)后第1、第3、第7天的BBB評(píng)分均升高，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后第1、第3、第7天后肢BBB評(píng)分比較

表1 各組大鼠術(shù)后第1、第3、第7天后肢BBB評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 各組電針治療后HE染色情況

假手術(shù)組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)良好，胞核完整，分布均勻；而模型組細(xì)胞核腫脹、核仁消失，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，軸突斷裂甚至消失；電針組在神經(jīng)元數(shù)量上較模型組有明顯改善，細(xì)胞腫脹消失，胞核增多，見圖1。

圖1 電針治療后脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×400）

2.3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

Western blotting結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組中Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，電針組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見表2和圖2。

表2 各組大鼠脊髓組織中Bcl-2、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量

表2 各組大鼠脊髓組織中Bcl-2、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖2 各組大鼠脊髓組織中的Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠脊髓組織miR-124-3p的表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組miR-124-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，電針組miR-124-3p表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠脊髓組織miR-124-3p相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

SCI在中醫(yī)上可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“骨痹”、“痿證”范疇，又有醫(yī)家稱之為“體惰”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，督脈瘀阻是SCI的基本病機(jī)。督脈瘀阻，則氣血逆亂，瘀滯經(jīng)絡(luò)，氣血無(wú)法濡養(yǎng)溫煦肢體[11]。臨床上，西醫(yī)治療包括了手術(shù)療法、藥物治療、細(xì)胞分子生物療法、生物材料、高壓氧療法等[12]；而中醫(yī)常通過(guò)中藥和針灸療法疏通經(jīng)絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行。其中，電針是臨床上常用的治療SCI的方法[13]，能夠加強(qiáng)針感，具有針刺和電刺激的雙重效應(yīng)，既能宣通氣血，又能通經(jīng)活絡(luò)，還具有減少氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕水腫、抑制炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)纖維化、抑制細(xì)胞凋亡等作用[14]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞有規(guī)律的發(fā)生程序性死亡的過(guò)程，以確保細(xì)胞形成速率和細(xì)胞死亡之間的穩(wěn)態(tài)平衡，是一種“自殺”的現(xiàn)象[15]。異常的細(xì)胞凋亡使正常的神經(jīng)受到損傷，受損后的神經(jīng)變性導(dǎo)致多種退行性神經(jīng)疾病的發(fā)生[16]。SCI后組織內(nèi)部出血、水腫引發(fā)神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)軸突斷裂致使神經(jīng)傳導(dǎo)中斷，神經(jīng)系統(tǒng)功能受到不同程度的破壞[17]。因此，最大限度減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，能提高神經(jīng)功能恢復(fù)概率。Bcl-2基因家族作為細(xì)胞凋亡的重要因子，歷來(lái)被學(xué)者廣泛研究。而Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最具代表性的基因，兩者分別為抑凋亡基因和促凋亡基因，它們之間的平衡決定了凋亡的誘導(dǎo)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，電針治療能夠下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控SCI后神經(jīng)元恢復(fù)的水平。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與SCI后繼發(fā)性損傷與修復(fù)過(guò)程[19]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-21可能通過(guò)抑制促凋亡蛋白FASLG對(duì)脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)發(fā)揮保護(hù)作用[20]。Wei等[21]發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-383可通過(guò)靶向提高GDNF蛋白表達(dá)來(lái)增細(xì)強(qiáng)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)SCI的治療作用，miR-383可能為治療SCI的靶點(diǎn)。miR-124被認(rèn)為可能是神經(jīng)退行性疾病的重要調(diào)節(jié)劑[22]，其廣泛表達(dá)于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不僅可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，而且還參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miR-124-3p的增加可以抑制神經(jīng)元炎癥，促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)[24]。Ge等[25]研究中，miR-124-3p被轉(zhuǎn)移到海馬神經(jīng)元中，通過(guò)靶向Rela/ApoE信號(hào)通路緩解神經(jīng)退行性變。Geng等[26]發(fā)現(xiàn)，miR-124-3p通過(guò)抑制神經(jīng)毒性、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激來(lái)減輕體外帕金森病模型中MPP+誘導(dǎo)的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，電針治療能夠顯著上調(diào)脊髓組織中miR-124-3p的表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)。

綜上所述，電針治療可能通過(guò)上調(diào)miR-124-3p的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)SCI后大鼠損傷神經(jīng)的修復(fù)和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，但調(diào)控miR-124-3p的機(jī)制尚不明確，有待今后進(jìn)一步研究。