純芝麻醬中花生致敏蛋白Ara h2、Ara h3及芝麻蛋白2S albumim的分析鑒定比較

任秀，王亞萍，白繼超，周巍，張曉東，陳怡文，崔生輝*，林蘭*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

（2.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北石家莊 050071）

芝麻味甘、性平，有補血明目等多種功效，可用于治療頭發(fā)早白、貧血萎黃等癥[1,2]。芝麻醬由炒熟的芝麻仁研磨而成，呈黏稠糊狀，有香味，可調(diào)味可佐餐[3]，其中含豐富蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)[4]，受到廣大消費者的喜愛。芝麻與花生售價懸殊，一些企業(yè)為獲得更高的利潤，在芝麻醬中摻入花生成分，甚至使用霉爛花生、玉米糕粉加入其它植物油和添加劑等制作沒有芝麻的芝麻醬[5]。1995年，聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）認定了8種最常見的致敏食物，可引起90%以上食物過敏反應，花生即為其中之一[6]。文獻報道，世界范圍內(nèi)花生過敏人群不在少數(shù)，美國約為1.1%[7]，丹麥約為0.2%～0.4%[8]，英國約為0.5%[9]。我國對花生過敏的人群也在增多。經(jīng)調(diào)查顯示，協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應科約有4%就診患者因食用花生而引起過敏[10]?；ㄉ械闹旅粑镔|(zhì)熱穩(wěn)定性高、耐酸、耐酶解，一般的生產(chǎn)方式無法去除[11]，僅100 μg花生足以引起敏感人群輕度過敏，如蕁麻疹[12]，若攝入較多，則會引起嚴重的過敏反應，如皮炎、哮喘、呼吸困難乃至死亡[13]。因此，為保證消費者的飲食安全，很多發(fā)達國家在食品包裝標簽中強制要求標識花生等過敏原成分[14]。

目前國內(nèi)外檢測過敏成分主要針對過敏原蛋白和DNA殘留進行[15]，主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫印跡法、聚合酶鏈式反應法（PCR）、實時熒光定量PCR法（Real-time PCR）、生物傳感器法及質(zhì)譜法等。這些方法中，酶聯(lián)免疫吸附法發(fā)展較為成熟，實時熒光定量PCR檢測法特異性較高[16,17]，二者各有優(yōu)缺點，檢測結(jié)果也有一定差異。張曉東等[18]使用實時熒光定量PCR法與酶聯(lián)免疫吸附法在核桃露（乳）飲品中檢測花生和大豆成分也印證這一發(fā)現(xiàn)。

針對芝麻檢測的主要過敏蛋白是芝麻2S albumin蛋白（又名2S白蛋白），在芝麻蛋白中所占比例較高，約為25%，是主要的致敏蛋白。目前權(quán)威認可的花生過敏原有11種，Ara h2、Ara h3是主要作為檢測的過敏原，可被90%花生過敏患者識別，其中Ara h2被認為是致敏性最強的花生過敏原。

查閱文獻，目前暫無文獻報道實時熒光定量PCR檢測法與酶聯(lián)免疫吸附法應用于芝麻醬中花生源檢測結(jié)果對比分析。2017年原國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的食品補充檢驗方法《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》（BJS 201707）（以下簡稱補充檢驗方法）中[19]，推薦應用實時熒光定量PCR方法特異性檢測植物蛋白飲料中的花生源性成分。本研究使用酶聯(lián)免疫吸附法和補充檢驗方法中推薦的實時熒光定量PCR法對市售純芝麻醬中花生源性成分進行了檢測及對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

十六烷基三甲基溴化銨緩沖液（CTAB），德國amresco公司；蛋白酶K（20 mg/mL），德國Roche公司；DNA提取液（酚:氯仿:異戊醇=25:24:1），北京索萊寶公司；DNeasy Plant Mini Kit試劑盒，德國Qiagen公司；PCR試劑盒，中國Takara公司；QubitTMdsDNA BR Assay kit，美國賽默飛世爾公司；PA3-EK-96花生過敏原檢測試劑盒，美國BioFront公司。

CTAB裂解液：20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L EDTA，pH=8.0。

1.1.2 引物及探針

參照《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》（BJS 201707）補充檢驗方法提供的芝麻源和花生源引物及探針序列（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，經(jīng)PAGE方法進行純化。

表1 芝麻源和花生源檢測用引物及探針序列Table 1 Primer and probe sequence for detection

1.1.3 樣品

純芝麻醬樣品采集：從超市（48批次）、菜市場（12批次）及網(wǎng)絡店家（30批次）采購芝麻醬樣品90批次，標簽標識均聲稱僅使用芝麻作為原料。其他樣品采集：花生、芝麻、核桃、杏仁、榛子、大豆實物樣品，均購于北京大型超市，組織研磨儀粉碎成粉末后待用。

1.2 儀器與設備

SWB25恒溫振蕩水浴，美國賽默飛世爾公司；PL2002電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；Qubit 1.0核酸蛋白定量儀，美國Invitrogen公司；ND2000核酸蛋白分析儀，美國賽默飛世爾公司；CFX96實時熒光定量PCR儀，德國Bio-Rad公司；TissueLyser II組織研磨儀，德國QIAGEN公司；Synergy HT多功能酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR方法

1.3.1.1 DNA提取

將芝麻醬樣品靜置，棄上層油層后，混勻，稱取300 mg芝麻醬樣品于2 mL離心管中，加入適量滅菌玻璃珠，使用組織研磨儀在290 Hz頻率下研磨3 min。研磨后，加入600 μL CTAB緩沖液和10 μL蛋白酶K，56 ℃恒溫震蕩30 min。震蕩結(jié)束后，吸取消化液500 μL，2000 r/min離心15 min后，吸取上清液至新的2 mL離心管中，加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，震蕩均勻，12000 r/min離心20 min后，棄上清液，將沉淀用柱式DNA提取試劑盒進行純化?；ㄉ葘嵨飿悠稤NA使用DNeasy Plant Mini Kit試劑盒，參考說明書方法進行提取。提取后使用Qubit 1.0核酸蛋白定量儀及ND2000核酸蛋白分析儀進行DNA濃度及純度測定。

1.3.1.2 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR方法進行純芝麻醬中芝麻蛋白2S albumin基因及花生致敏蛋白Ara h2基因檢測。檢測反應體系為25 μL，其中10×PCR buffer緩沖液2.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）1 μL，50 μmol/L上游及下游引物各0.2 μL，50 μmol/L探針0.2 μL，5 U/μL Taq酶0.15 μL，DNA模板2 μL，用無菌去離子水補至25 μL。反應條件如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（收集熒光），40個循環(huán)；12 ℃保存。每個樣品獨立重復檢測三次，每次檢測時設置兩個平行復孔。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法

1.3.2.1 蛋白提取

參考試劑盒說明書方法進行。具體方法如下：將芝麻醬樣品靜置，棄上層油層后，混勻，稱取100 mg芝麻醬樣品于1.5 mL離心管中，加入900 μL預熱至100 ℃的1×抽提緩沖液，混勻并短時震蕩使管中物品懸浮。置于99 ℃恒溫震蕩水浴中孵育10 min，孵育期間使用950 r/min轉(zhuǎn)速進行震蕩。結(jié)束后，室溫2000 r/min離心10 min，取上清液200 μL轉(zhuǎn)移至96孔檢測板中。

1.3.2.2 花生致敏蛋白Ara h3酶聯(lián)免疫吸附法檢測

將檢測板在室溫下孵育10 min后，棄去孔中物品，在吸水紙上拍打去除剩余液體。用1×洗滌緩沖液（WB）洗滌三次。每次用量≥200 μL。而后在每孔中加入100 μL 1×花生抗體耦合物（CON）。將檢測板置于黑暗環(huán)境中室溫孵育10 min。棄去孔中物品，再次洗滌。在每孔中加入100 μL HRP底物（SUB）。將檢測板置于黑暗環(huán)境中孵育10 min。在每孔中加入100 μL淬滅溶液（STOP）。使用酶標儀在450 nm處讀取各孔的吸光度值。結(jié)合三階多項式曲線擬合，進行花生致敏蛋白Ara h3成分的含量計算。每個樣品獨立重復檢測三次，每次每個樣品設置兩個平行復孔。每次樣品檢測同時測定試劑盒提供的標準蛋白，以用于標準曲線的繪制。

1.3.3 方法學驗證

實時熒光定量PCR方法稱取300 mg樣品提取DNA，酶聯(lián)免疫吸附法稱取100 mg樣品提取蛋白，按照以下方法進行驗證。

特異性：芝麻、核桃、杏仁、榛子、大豆進行檢測，與花生比較結(jié)果。

重復性：花生樣品提取后獨立進行三次重復檢測。

靈敏度：花生樣品提取后，無菌去離子水進行10倍系列稀釋，從10-1稀釋至10-6后進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR法：查看樣品檢測的原始擴增曲線是否正常，若存在擴增曲線不典型、異?；驍U增CT值結(jié)果與直觀可見結(jié)果不符時，在熒光信號閾值設置中將熒光本底信號扣除以進行校正，結(jié)果保留兩位小數(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附法：根據(jù)花生過敏原檢測試劑盒中所帶標準蛋白質(zhì)控樣品檢測結(jié)果，繪制OD值與蛋白濃度的標準曲線。將樣品檢測的OD值結(jié)果帶入標準曲線計算所測得的蛋白濃度，結(jié)果保留兩位小數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種花生成分檢測方法的驗證結(jié)果

芝麻、核桃、杏仁、榛子、大豆及花生實物樣品粉末提取DNA后，使用Qubit 1.0核酸蛋白定量儀進行濃度測定，提取的DNA濃度均大于10 ng/μL，A260/280吸光度比值均在1.8～2.2之間。使用花生Ara h2基因引物及探針對芝麻、核桃、杏仁、榛子、大豆及花生DNA進行熒光定量PCR檢測，擴增CT值均大于40（見圖1）；同時使用花生Ara h3蛋白酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒對上述樣品進行檢測，除花生外，其余樣品結(jié)果均顯示為陰性（見表2）。

表2 實時熒光定量PCR法及酶聯(lián)免疫吸附法特異性檢測結(jié)果Table 2 Test results of real-time PCR and ELISA

使用實時熒光定量PCR法對從花生樣品提取的DNA進行三次獨立重復檢測，CT值基本一致（MeanCT=23.54，RSD=1.4%）（見圖2）；使用酶聯(lián)免疫吸附法對從花生樣品提取的蛋白進行三次重復檢測，結(jié)果均為陽性（見表3）。

表3 實時熒光定量PCR法及酶聯(lián)免疫吸附法重復性檢測結(jié)果Table 3 Repeatability test results of real-time PCR and ELISA

驗證結(jié)果顯示，兩種花生成分檢測的方法，特異性及重復性良好、穩(wěn)定。因此，本研究所用的兩種方法均適用于芝麻醬樣品中花生源的檢測，可為今后相關研究提供基礎數(shù)據(jù)。

實時熒光定量PCR方法可對花生樣品10-3稀釋度DNA提取液檢出，10-4稀釋度不可檢出；酶聯(lián)免疫吸附法均可對花生樣品10-1至10-6稀釋度蛋白提取液檢出（見圖3）?？梢娒嘎?lián)免疫吸附法靈敏度更高，具體檢測結(jié)果匯總見表4。

表4 實時熒光定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度檢測結(jié)果Table 4 Sensitivity test results of real-time PCR and ELISA

2.2 樣品檢測結(jié)果

2.2.1 實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果

使用Qubit 1.0核酸蛋白定量儀進行測定顯示，從90批次芝麻醬樣品中提的DNA濃度介于0.10 ng/μL至45.80 ng/μL之間，A260/280吸光度比值均在1.8～2.2之間。通過實時熒光定量PCR方法，90批次樣品DNA均檢出芝麻蛋白2S albumin基因，CT值介于22.00～33.80之間，檢測結(jié)果見表5。使用實時熒光定量PCR方法與酶聯(lián)免疫吸附方法進行花生成分檢測驗證時，花生樣品均可檢出，芝麻、核桃等其余5種樣品均未能檢出，無交叉影響，方法重復檢測3次后結(jié)果一致、穩(wěn)定。其中45批次樣品DNA（50.00%）檢測出花生致敏蛋白Ara h2基因，其CT值介于25.60～38.60之間（見表5）。

表5 實時熒光PCR法檢測芝麻源DNA結(jié)果Table 5 Results of real-time PCR detection of sesame-derived DNA

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果

90批次芝麻醬樣品中，使用酶聯(lián)免疫吸附法，83批次樣品中檢出花生過敏蛋白Ara h3，其中有62批次蛋白含量的檢測值大于80.00 mg/kg，45批次與實時熒光定量PCR法花生致敏蛋白Ara h2基因檢測結(jié)果一致；其余21批次的蛋白含量在2.60～78.00 mg/kg之間，這些樣品實時熒光定量PCR法均未檢出花生致敏蛋白Ara h2基因（表6）。

表6 實時熒光PCR法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測花生源結(jié)果Table 6 Results of real-time PCR and ELISA detection of sesame-derived DNA

2.3 討論

實時熒光定量PCR方法檢測芝麻2S albumin基因時，所有樣品均可檢出，可見市售芝麻醬均使用了芝麻作為加工原料，未存在不使用芝麻制作的造假行為。理論上，CT值與待擴增樣品DNA含量成反比，DNA濃度越高，CT值越小。本研究中CT值小于30.00的為77批次純芝麻醬存在DNA濃度很低的樣品（0.1 ng/μL），不符合理論情況。實時熒光定量PCR方法與酶聯(lián)免疫吸附方法檢測花生成分時，酶聯(lián)免疫吸附方法檢測出的陽性樣品更多，方法更靈敏。酶聯(lián)免疫吸附方法與實時熒光定量PCR方法靈敏度有大于1000倍的差異（見表4）。在90批次真實樣品的花生成分檢測中，酶聯(lián)免疫吸附法檢出花生成分的樣品比實時熒光定量PCR檢測方法檢出花生成分的樣本多38個，主要集中在酶聯(lián)免疫吸附法檢出蛋白含量較低的濃度范圍內(nèi)（≤80.00 mg/kg）。在酶聯(lián)免疫吸附法檢出花生成分的蛋白含量≥80.00 mg/kg時，有72.60%（45/62）的樣品可被實時熒光定量PCR方法檢出。

芝麻醬進行加工制作時，需要經(jīng)過除雜、清洗和烘焙等工藝[20]，其中烘烤和磨漿最為關鍵[21]。烘烤時原料會經(jīng)過約150 ℃高溫處理15～20 min后迅速降到25 ℃研磨，會嚴重破壞DNA結(jié)構(gòu)，放置過程也會緩慢降解，即使DNA濃度可檢測（見表5）也無法進行正常的PCR擴增反應或擴增CT值滯后。另外，實時熒光定量PCR方法基于花生過敏原Ara h2致敏蛋白的基因，檢測時要通過檢測編碼過敏蛋白的基因進行間接檢測，芝麻醬加工工藝會在一定程度上將DNA及蛋白分離，PCR手段檢測結(jié)果也會受到影響，以致實時熒光定量PCR方法靈敏度受到限制。酶聯(lián)免疫吸附法檢測基于花生過敏原Ara h3蛋白，此蛋白屬于Cupin超家族（Cupin Superfamily）中11S球蛋白六聚體（豆球蛋白）的一種，結(jié)構(gòu)上有至少6個β-折疊形成的桶狀結(jié)構(gòu)，比較穩(wěn)定，其三級結(jié)構(gòu)具耐熱性[22]，因此檢測時具有更好的靈敏度。

純芝麻醬中檢出花生源成分的情況時有發(fā)生。查閱文獻，袁茵等[23]使用PCR方法檢測17批次純芝麻醬樣品，發(fā)現(xiàn)64.70%（11/17）的樣品中含有花生成分；謝文佳等[24]使用LAMP技術(shù)檢測市場流通環(huán)節(jié)標識為純芝麻醬的41批次樣品中植物源成分，43.90%（18/41）的樣品中檢出花生源成分。二人檢測結(jié)果中花生檢出率與本研究中熒光定量PCR方法花生檢出率（50.00%，45/90）基本一致。由于檢測芝麻醬中花生源成分時，未見應用酶聯(lián)免疫吸附法進行相關研究的報道，因此無法比較本研究與其他研究人員檢測數(shù)據(jù)是否一致。

3 結(jié)論

3.1 本研究中，實時熒光定量PCR方法更方便快捷，但對于樣品中花生含量較低的樣品檢測時存在一定難度，可能存在假陰性結(jié)果。而酶聯(lián)免疫吸附法雖檢測價格較高，但靈敏度高，可檢出的花生含量更低。兩種方法檢測結(jié)果在高濃度樣品中具同一性，在考慮加工工藝、食品樣品特點等情況后，預估花生成分含量較高的食品樣品可選擇使用本研究中實時熒光定量PCR方法檢測，較低或無法預估的則可使用本研究中酶聯(lián)免疫吸附法檢測。

3.2 目前本研究方法只能進行樣品中花生源定性及含量小于80.00 mg/kg濃度下的半定量檢測，無法具體測算樣品中所含花生及芝麻比例。鑒于一些廠家生產(chǎn)線可能存在多個產(chǎn)品共線加工的情況，本研究還無法區(qū)分交叉污染。下一步我們將更加深入研究，希望能對樣品中花生源成分檢出是否存在惡意添加行為找到線索。

3.3 本研究中檢測的樣品均為純芝麻醬，廠家未在標簽標示中說明可能存在其他過敏原情況。依據(jù)《預包裝食品標簽通則》（GB 7718），花生為必須標識的致敏物質(zhì)，無論用作配料還是加工帶入均應提示。若屬于過敏人群的消費者認為純芝麻醬中只有芝麻成分而誤食，則會造成不可設想的嚴重后果。目前我國現(xiàn)有的芝麻醬相關標準為國家糧食局發(fā)布的《LS/T 3220-2017 芝麻醬》行業(yè)標準，其中涉及的主要為感官、微生物及理化檢測指標，并無過敏原檢測標準。監(jiān)督執(zhí)法人員在日常執(zhí)法工作中會陷入即使廠家有違法違規(guī)行為卻無法可依、無法懲處的困境。綜上，建議相關監(jiān)管部門加大市場流通環(huán)節(jié)純芝麻醬樣品標簽標識不符情況的查處力度，盡快建立芝麻醬中過敏原檢測的相關規(guī)范或標準，推動及規(guī)范市場更加有序，保障人民飲食安全。