丹參川芎嗪注射液對(duì)阿爾茨海默癥小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)炎性因子、Tau蛋白表達(dá)的影響

姜 冉,李慧明,李 贊,陳曉燕,丁嘉科,陳永衡

(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219)

阿爾茨海默癥(AD)是一種認(rèn)知功能逐漸衰退的慢性神經(jīng)退行性疾病。隨著人口老齡化，預(yù)計(jì)30年后，全世界每85人中就有一人患該疾病，大約43%的AD患者需要高水平護(hù)理，這給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，因此AD的防治研究具有重要意義。AD標(biāo)志性病理學(xué)改變表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白聚集而成的老年斑、過度磷酸化的Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元和突觸的減少甚至丟失[2]。AD發(fā)病機(jī)制尚未明確，已有研究顯示慢性炎癥影響AD病理的以上3個(gè)特征[3]。因此，神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是治療AD的潛在靶點(diǎn)。許多中藥具有多靶點(diǎn)抗炎、不良反應(yīng)少、作用溫和等特點(diǎn)，在預(yù)防和治療AD中受到越來(lái)越多關(guān)注。丹參川芎嗪注射液是一種中藥復(fù)方制劑，主要成分為鹽酸川芎嗪和丹參素，常用于治療腦梗死、腦出血、急性顱腦損傷、心絞痛等心腦血管疾病[4-6]，而且該藥具有抗炎作用[7-8]，但其是否能通過抗炎作用發(fā)揮抗AD作用尚不清楚。本研究通過腦內(nèi)注射Aβ25-35建立小鼠AD模型，觀察了丹參川芎嗪注射液對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)及空間識(shí)別記憶的影響，并從腦內(nèi)炎癥因子和磷酸化Tau蛋白(p-Tau)堆積方面探討了該藥的作用機(jī)制，旨在為臨床防治AD提供新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)小鼠48只，雌雄各半，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度維持(22±3)℃，濕度維持于45%～65%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2主要藥物、器材和試劑 丹參川芎嗪注射液(貴州拜特制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H52020959)；鹽酸多奈哌齊(重慶植恩藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010723)；腦立體定位儀；Morris 水迷宮；病理切片機(jī)。Aβ25-35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白(10735078001)購(gòu)自Roche公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9033)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液(AS1055A)、伊紅染液(AS1094)、HRP標(biāo)記兔抗山羊、HRP標(biāo)記山羊抗兔、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠和HRP標(biāo)記山羊抗大鼠購(gòu)自Aspen公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海豐翔生物科技有限公司；p-Tau抗體購(gòu)自Affinity公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表將48只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、鹽酸多奈哌齊組及丹參川芎嗪低、中、高劑量組，每組8只。小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀，沿顱骨中線剪開約1 cm，暴露前囟門。除空白組外，其余組小鼠參考文獻(xiàn)[9]方法，于右側(cè)海馬CA1區(qū)(右腦室定位，以囟門為零點(diǎn)，后0.3 mm，矢狀縫旁開1 mm，進(jìn)針深度為顱骨下2.5 mm)注射2 μg/μL的Aβ25-353 μL建立AD模型，術(shù)后創(chuàng)面涂抹青霉素，小鼠單籠飼養(yǎng)。造模7 d后，參考文獻(xiàn)[10]給藥劑量，鹽酸多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊1.3 mL/kg腹腔注射，丹參川芎嗪低、中、高劑量組分別給予丹參川芎嗪注射液0.7 mL/kg、1.3 mL/kg、2.6 mL/kg腹腔注射，空白組、模型組給予生理鹽水腹腔注射，均1次/d，連續(xù)4周。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 干預(yù)結(jié)束后開始水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前于水中混入可食白色素，減少視覺干擾，在每次測(cè)試后清洗池側(cè)壁以確保消除嗅覺提示。定向航行實(shí)驗(yàn)：將小鼠面向池壁從不同象限放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期(若小鼠60 s內(nèi)不能找到則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其到平臺(tái)上停留10 s，再放回到籠中)，連續(xù)實(shí)驗(yàn)5 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后撤去平臺(tái)，測(cè)量小鼠對(duì)平臺(tái)空間位置的準(zhǔn)確記憶情況，記錄各組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間、穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)。

1.4.2新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d后，參考文獻(xiàn)[11],在小鼠完全自由的狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：先進(jìn)行訓(xùn)練，即在曠場(chǎng)內(nèi)兩個(gè)相鄰對(duì)稱處各放置1個(gè)完全相同的物體，記錄5 min內(nèi)小鼠嗅探2個(gè)物體的時(shí)間；訓(xùn)練結(jié)束1 h后進(jìn)行測(cè)試，將訓(xùn)練時(shí)小鼠嗅探過的2個(gè)物體其中的1個(gè)用新物體取代，記錄5 min內(nèi)小鼠嗅探新物體和舊物體的時(shí)間。計(jì)算探索時(shí)間和偏愛指數(shù)。偏愛指數(shù)=嗅探新物體的時(shí)間/總嗅探時(shí)間×100%。

1.4.3腦組織HE染色病理觀察 行為學(xué)測(cè)試完成后次日，采用4%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定，剪開皮膚及胸廓，暴露心臟，將100 mL生理鹽水緩慢注入左心室，再用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭分離出腦組織，用生理鹽水清洗后放入4%多聚甲醛中固定。制備石蠟切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)，使用Image J軟件對(duì)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.4腦組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)情況 每組隨機(jī)取4只小鼠腦組織，使用勻漿器將其制成10%的腦組織勻漿，4 ℃下4 500 r/min離心(離心半徑13.5 cm)10 min，收集上清液。使用ELISA法在連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上檢測(cè)IL-1β、TNF-α表達(dá)量。

1.4.5腦組織中p-Tau蛋白免疫組化檢測(cè) 取各組小鼠腦組織石蠟切片，脫蠟至水，置于EDTA緩沖液中微波修復(fù)，然后置于3%過氧化氫溶液中室溫下避光孵育10 min，甩干后用5% BSA封閉20 min，加入稀釋的p-Tau抗體50 μL覆蓋組織，4 ℃過夜。加50～100 μL 相應(yīng)種屬的二抗，37 ℃孵育50 min；加新鮮配制的DAB溶液50～100 μL。各步驟間PBS洗滌3次，顯色完全后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化約1 s，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。將膠片進(jìn)行掃描存檔，使用AlphaEase FC軟件處理系統(tǒng)分析光密度值。

1.4.6腦組織中p-Tau蛋白Western blot檢測(cè) 取各組小鼠腦組織，用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次后，剪成小塊置于勻漿器中，加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑冰浴勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中振蕩，冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，使勻漿液完全裂解。4 ℃下12 000 r/min離心(離心半徑5.9 cm)5 min，收集上清，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，化學(xué)發(fā)光顯影、定影。采用Image J軟件處理系統(tǒng)分析蛋白條帶，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 模型組小鼠定向航行實(shí)驗(yàn)第2～5天的逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于空白組(P均<0.05)，鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪高劑量組均明顯短于模型組(P均<0.05)。模型組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于空白組(P<0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯短于空白組(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪中、高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，目標(biāo)象限停留時(shí)間均明顯長(zhǎng)于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和阿爾茨海默癥各組小鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

2.2各組小鼠識(shí)別記憶能力比較 模型組小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中探索時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)，鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪中、高劑量組均明顯短于模型組(P均<0.05)；模型組小鼠偏愛指數(shù)明顯低于空白組(P<0.05)，鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪中、高劑量組均明顯高于模型組(P均<0.05);丹參川芎嗪高劑量組小鼠探索時(shí)間與偏愛指數(shù)與鹽酸多奈哌齊組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白組和阿爾茨海默癥各組小鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)探索時(shí)間和偏愛指數(shù)比較

2.3各組小鼠腦組織HE染色病理學(xué)表現(xiàn) 與空白組比較，模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞層次減少、排列紊亂、細(xì)胞固縮，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪中、高劑量組細(xì)胞層次增多、排列整齊、胞體大、結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元數(shù)量明顯多于模型組(P均<0.05)，丹參川芎嗪高劑量組神經(jīng)元數(shù)量明顯高于丹參川芎嗪中劑量組(P<0.05)，與鹽酸多奈哌齊組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

2.4各組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)情況 模型組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪各組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，丹參川芎嗪高劑量組均明顯低于丹參川芎嗪低、中劑量組(P均<0.05),與鹽酸多奈哌齊組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 空白組和阿爾茨海默癥各組小鼠腦組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)情況比較

2.5各組小鼠腦組織中p-Tau蛋白免疫組化檢測(cè)表達(dá)情況 模型組小鼠腦組織中p-Tau蛋白表達(dá)IOD值明顯高于空白組(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪各組小鼠腦組織中p-Tau蛋白表達(dá)IOD值均明顯低于模型組(P均<0.05)，且丹參川芎嗪各組呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3及圖4。

2.6各組小鼠腦組織中p-Tau蛋白Western blot檢測(cè)表達(dá)情況 模型組小鼠腦組織中p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和丹參川芎嗪中、高劑量組小鼠腦組織中p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且丹參川芎嗪高劑量組明顯低于丹參川芎嗪中劑量組(P<0.05)。見圖5。

3 討 論

AD的病因假說眾多，但尚未有任何一種假說可全面解釋此病。近年來(lái)，神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病機(jī)制中的作用被許多研究者重視[3]。在AD的初始階段，炎癥因子對(duì)于腦部神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，但隨著疾病進(jìn)展，炎癥因子持續(xù)作用和過度產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸的損傷凋亡[12]。

學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試通常被用于評(píng)估動(dòng)物的認(rèn)知功能。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種用來(lái)測(cè)定動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的方法[13],新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是用來(lái)測(cè)定動(dòng)物物體識(shí)別記憶能力的方法，二者常用來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物藥效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)減少，偏愛指數(shù)明顯下降，說明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶和物體識(shí)別能力下降，發(fā)生認(rèn)知功能障礙，證實(shí)Aβ25-35可破壞小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，成功建立AD模型。與模型組比較，丹參川芎嗪高劑量組逃避潛伏期均明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯增多，目標(biāo)象限停留時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，對(duì)新物體識(shí)別時(shí)間延長(zhǎng)，偏愛指數(shù)明顯升高，說明丹參川芎嗪注射液可以減輕AD小鼠的認(rèn)知功能障礙，提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶和物體識(shí)別能力。

目前研究發(fā)現(xiàn)，參與IL-1β合成的炎性酶caspase-1或nlrp3基因缺失，可提高AD小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的清除和認(rèn)知能力[14]，IL-1β等炎性因子的產(chǎn)生可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的清除能力。Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致促炎因子的釋放，這些因子誘導(dǎo)amyloid precursor protein (APP)產(chǎn)生，由于APP數(shù)量增加，導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生增多，炎性因子與Aβ相互影響而促進(jìn)AD的發(fā)展[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組腦組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)量明顯高于空白組，丹參川芎嗪中、高劑量組均明顯低于模型組，推測(cè)丹參川芎嗪注射液可能通過抗炎作用抑制APP的產(chǎn)生，使Aβ生成減少，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)Aβ所致學(xué)習(xí)記憶和物體識(shí)別能力的損傷。

炎癥信號(hào)可調(diào)節(jié)突觸修剪，過度的神經(jīng)炎癥會(huì)使突觸修剪功能失調(diào)，導(dǎo)致突觸相關(guān)蛋白丟失，從而損傷神經(jīng)元[16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬區(qū)注射Aβ會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元受損，神經(jīng)元數(shù)量減少，而丹參川芎嗪中、高劑量組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯高于模型組，提示丹參川芎嗪注射液對(duì)于腦部神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用。腦部神經(jīng)元上有許多炎癥因子受體，導(dǎo)致炎癥信號(hào)可直接激活神經(jīng)蛋白激酶和磷酸酶，進(jìn)而加劇Tau蛋白磷酸化，且炎癥因子的刺激導(dǎo)致Aβ斑塊周圍活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，促進(jìn)GSK3β和p38-MAPK的活化，導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化水平升高[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中p-Tau蛋白表達(dá)量明顯高于空白組，丹參川芎嗪中、高劑量組均明顯低于模型組。表明丹參川芎嗪注射液可以通過抑制炎癥反應(yīng)，減少Tau蛋白磷酸化，保護(hù)神經(jīng)元。

綜上所述，丹參川芎嗪注射液可能通過抑制炎性反應(yīng)，減少Tau蛋白磷酸化而起到改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶和物體識(shí)別能力，減少神經(jīng)元損傷作用，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。