健脾益腎活血方對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin和Podocin表達的影響

關 冰，田 雪，李偉男，吳艷萍，金勁松，袁 軍

(湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，湖北 武漢 430061)

膜性腎病是成人腎病綜合征最常見的病因，約占原發(fā)性腎小球疾病的16.8%，位居原發(fā)性腎小球疾病的第二位，30%～40%的患者在5～15年之間進展為終末期腎臟病[1]。本病主要采用激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和利妥昔單抗等藥物治療，但長期療效不理想，不良反應較明顯，且復發(fā)率高。目前認為足細胞裂孔隔膜蛋白Nephrin與Podocin的分離及表達的減少是導致膜性腎病蛋白尿發(fā)生發(fā)展的重要機制[2]。中醫(yī)藥治療膜性腎病的研究頗多，患者中醫(yī)辨證以脾腎氣陽虛證最為多見，實證以血瘀證占比最多[3]，健脾益腎活血方即根據(jù)該病特點而設。為探討健脾益腎活血方治療 膜性腎病的作用機制，本研究通過被動型Heymann腎炎大鼠模型，觀察了該方對膜性腎病大鼠腎組織中Nephrin與Podocin表達的影響。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠40只，體重190～220 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2020-0018。大鼠飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院動物實驗中心，室內(nèi)溫度控制在20 ℃左右，相對濕度50%～70%。

1.2主要試劑 羊抗鼠Fx1A血清(Probetex，批號：PTX-002S)；抗Nephrin抗體C端(Abcam，批號：ab183099)；抗NPHS2 抗體(Abcam，批號：ab93650)；兔抗鼠IgG H&L (HRP，Abcam，批號：ab6734)；抗C3抗體(Abcam，批號：ab200999)；FITC山羊抗兔IgG(Bioswamp，批號：SAB43712)；抗熒光衰減封片劑(含DAPI，Solarbio，批號：S2110)。

1.3藥物 健脾益腎活血方組成：黃芪30 g、黨參15 g、淫羊藿15 g、白術15 g、當歸12 g、川芎15 g、益母草30 g、穿山龍30 g，藥物購自江陰天江藥業(yè)有限公司。鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司，國藥準字H20000292，批號：X3104)。藥物劑量參照《醫(yī)學實驗動物學》人與動物之間的用藥劑量換算，200 g大鼠用藥約為70 kg體重人服用劑量的6.3倍。

1.4實驗方法 將40只健康SPF雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組，每組10只。各組大鼠適應性喂養(yǎng)后檢測24 h尿蛋白定量均小于10 mg后開始造模。正常組大鼠一次性尾靜脈注射生理鹽水0.6 mL/100 g，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組一次性尾靜脈注射Fx1A血清0.6 mL/100 g，造模后測定24 h尿蛋白定量>10 mg則為模型建立成功(造模后貝那普利組及健脾益腎活血組各死亡1只，予以剔除)。造模后第1天開始，貝那普利組給予0.15 mg/mL鹽酸貝那普利片懸混液灌胃，健脾益腎活血組給予生藥濃度為2.5 g/mL的健脾益腎活血湯灌胃，正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，均1次/d，每次3 mL，連續(xù)灌胃4周。健脾益腎活血組在灌胃第3周時死亡1只，予以剔除。

1.5標本采集與檢測

1.5.124 h尿蛋白定量檢測 用代謝籠收集各組大鼠灌胃1周、2周、3周、4周后的24 h尿液，檢測24 h尿蛋白定量。

1.5.2血生化指標檢測 采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉并處死大鼠，心臟取血，離心后取上層，檢測血清總蛋白、血清白蛋白、血肌酐、總膽固醇、三酰甘油水平。

1.5.3腎臟組織病理觀察 ①摘取各組大鼠雙側腎臟，去掉包膜，分切腎組織，部分進行多聚甲醛固定后制備石蠟切片。將3 μm石蠟切片脫蠟后按常規(guī)方法進行PAS、Masson染色。②另取石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，高溫高壓抗原修復冷卻，PBS沖洗3次，每次3 min，3%過氧化氫避光孵化15 min，滴加一抗(IgG 1∶500、C3 1∶200)4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗，室溫孵育30 min,完畢后PBS沖洗3次，每次3 min，加入300 μL 抗熒光淬滅封片液(含DAPI)封片，免疫熒光顯微鏡下觀察IgG和C3沉積情況。③取部分腎組織，切成小塊后浸入2.5%戊二醛-PBS溶液中固定，日立(Hitachi)透射電鏡(型號：HT7800)下觀察腎臟足細胞足突變化及電子致密物沉積情況。

1.5.4腎組織中Nephrin、Podocin免疫熒光檢測 取腎組織冰凍切片，用丙酮固定15 min后用1 mL PBS洗3次，每次3 min，棄去PBS；加入1 mL 3% BSA，37 ℃封閉1 h，棄去封閉液；加入300 μL PBS稀釋后的抗體(兔抗大鼠Nephrin 1∶50,Podocin 1∶50)，4 ℃孵育過夜；用1 mL PBS洗2 次，每次5 min，棄去PBS；加入300 μL PBS稀釋后的熒光二抗，37 ℃孵育1 h；用1 mL PBS洗2次，每次5 min，棄去PBS；加入300 μL抗熒光淬滅封片液(含DAPI)；熒光顯微鏡尼康(Nikon)80i觀察拍照，采用NIS-Elements AR Analysis 5.21.00對圖片進行強度平均值分析，用以表示Nephrin、Podocin抗體的表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠24 h尿蛋白定量比較 造模1～4周，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組大鼠24 h蛋白尿定量均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃1周和2周后，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組大鼠24 h蛋白尿定量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；灌胃3周后，模型組大鼠24 h蛋白尿定量達峰值，貝那普利組及健脾益腎活血組從灌胃2周后開始逐漸降低；灌胃3周、4周后貝那普利組及健脾益腎活血組大鼠24 h蛋白尿定量均明顯低于同期模型組(P均<0.05)，健脾益腎活血組與貝那普利組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1。

2.2各組大鼠血清生化指標比較 模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組血清白蛋白水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組血清膽固醇水平和模型組、健脾益腎活血組血清三酰甘油水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各組血肌酐水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組、貝那普利組及健脾益腎活血組上述各指標水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2。

2.3各組大鼠腎臟組織病理學表現(xiàn) PAS染色顯示模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組可見基底膜增厚，部分系膜基質增生。Masson染色顯示：模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組大鼠腎臟組織上皮下可見嗜復紅蛋白沉積。免疫熒光染色顯示：正常組大鼠腎組織中IgG和C3均為陰性，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組大鼠腎臟組織中IgG和C3均沿毛細血管壁呈細顆粒樣沉積。電鏡顯示：正常組大鼠腎組織足細胞結構完整，足突排列清晰，未見融合；模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組大鼠腎臟組織中足突彌漫性融合，基底膜彌漫增厚，上皮下電子致密物沉積。見圖3。

2.4各組大鼠腎臟組織中Nephrin與Podocin表達情況 正常組大鼠腎臟組織中Nephrin與Podocin沿腎小球毛細血管襻均勻分布，陽性染色蛋白分布均勻；與正常組比較，模型組、貝那普利組、健脾益腎活血組Nephrin與Podocin分布不均且表達明顯減少，Nephrin與Podocin表達平均熒光強度均明顯降低(P均<0.05)；貝那普利組、健脾益腎活血組異常改變較模型組輕，Nephrin與Podocin表達平均熒光強度均明顯高于模型組(P均<0.05)；健脾益腎活血組異常改變較貝那普利組輕，Nephrin與Podocin表達平均熒光強度均明顯高于貝那普利組(P均<0.05)。見圖4及圖5。

3 討 論

膜性腎病屬中醫(yī)“水腫”“尿濁”等范疇。總屬本虛標實，脾腎氣(陽)虛，瘀血阻滯是其基本病機[4]。從水腫而言，脾虛不能運化水濕，腎虛不能蒸騰津液，水濕內(nèi)停，泛溢肌膚而為水腫。從蛋白尿而言，腎虛失其封藏，精微物質流失，脾虛失其統(tǒng)攝，血中精微下泄，而為蛋白尿?？梢娖⒛I虧虛是水腫及蛋白尿的根本。氣為血帥，氣行則血行，氣虛則血行不暢，血液凝滯，發(fā)為血瘀；陽氣不足，陽虛失于溫煦，氣血鼓動無力，血液寒滯而凝，日久成瘀；久病易傷津耗液，津液虧虛，血脈失其濡潤而脈道澀滯，血行緩慢，血液黏滯而成瘀。瘀血的形成阻礙機體氣血運行，使機體虛弱更甚，加重脾腎虧虛，日久則氣虛益甚，瘀水互結日趨加重，從而形成惡性循環(huán)，使水腫或蛋白尿加重，甚至出現(xiàn)深靜脈血栓形成等并發(fā)癥。因此膜性腎病的治療當以健脾益腎活血為基礎。健脾益腎活血方中黃芪味甘、性微溫，歸肺脾經(jīng)，該藥益脾腎之氣以治本，固表利尿以治標，益氣得以行血而化瘀，固表則能防外邪之侵襲而防變，利尿而腫消。黨參、白術健脾益氣，淫羊藿補腎溫陽，合用以脾腎雙補。當歸、川芎活血化瘀，其中當歸既能活血，又能補血，扶正以化瘀；川芎辛溫通散，為血中氣藥，能通達氣血；益母草、穿山龍既能活血化瘀，又能利水祛濕。諸藥合用，可達健脾益腎活血之功效。該藥臨床用于膜性腎病的治療效果較好，但其作用機制尚不明確，為此本研究進行了相關探討。

被動型Heymann腎炎及陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)腎炎是研究人類膜性腎病最常用的兩種動物模型。C-BSA小鼠模型通過電荷作用植入抗原形成原位免疫復合物，可以制作Ⅰ～Ⅲ期的膜性腎病，但其需要長期多次尾靜脈注射，對動物損傷較大，且8周后容易導致小鼠死亡。被動型Heymann腎炎模型病變穩(wěn)定，一次性尾靜脈注射即可，疼痛刺激小，適用于膜性腎病的長期病變或防治研究。本實驗選用被動型Heymann腎炎模型，顯示在使用抗Fx1A抗體7～10 d后蛋白尿明顯增多，造模3周達到最高水平，然后呈逐漸減少趨勢；灌胃3周和4周后，貝那普利組及健脾益腎活血組大鼠24 h蛋白尿定量均明顯低于同期模型組，健脾益腎活血組與貝那普利組比較無差異；末次灌胃結束后，各造模組大鼠血清白蛋白水平均明顯低于正常組，血清膽固醇水平均明顯高于正常組，與臨床患者表現(xiàn)一致；模型組、貝那普利組及健脾益腎活血組各血清指標水平比較差異均無統(tǒng)計學意義。提示健脾益腎活血方可減少膜性腎病大鼠蛋白尿，但未發(fā)現(xiàn)對血清蛋白和血脂指標有明顯影響。

蛋白尿的產(chǎn)生與足細胞裂孔隔膜的結構與功能失調(diào)密切相關[5]。裂孔隔膜是腎小球最重要的濾過屏障，由多種蛋白分子組成，其中Nephrin與Podocin是足細胞裂孔隔膜的重要組成分子。Nephrin與NEPH1、FAT等蛋白分子間相互作用形成裂孔隔膜的分子濾過網(wǎng)，Podocin則參與裂孔隔膜和細胞骨架的連接，二者對裂孔隔膜的形成具有整合作用。同時，裂孔隔膜也是信息傳導平臺。Nephrin介導的信號通路能導致整合素 1的激活，調(diào)節(jié)足細胞與基底膜的附著[6]。Podocin則與TRPC6相互作用, 通過作為開關確定TRPC6激活來調(diào)節(jié)裂孔隔膜的屏障功能[7]，Podocin的缺乏可以激活TRPC6，從而導致裂孔隔膜功能失調(diào)[8]。本實驗熒光結果顯示，模型組大鼠腎臟組織中Nephrin與Podocin的熒光強度明顯弱于正常組，證實膜性腎病時Nephrin與Podocin表達減少，與文獻[2,9]報道一致。Verma等[10]研究報道，Nnephrin和Podocin表達減少，消弱了足細胞受傷后的恢復能力，足細胞密度下降，易于相互脫離，本實驗中模型組大鼠電鏡下可見足細胞廣泛融合，與該研究結果相符。最近的證據(jù)表明，在各類蛋白尿性腎病中內(nèi)吞作用增強[11-12]，其可快速下調(diào)細胞表面Nephrin表達，從而破壞裂孔隔膜完整性[13]。本研究中Nephrin的表達下降是否與內(nèi)吞作用相關尚不清楚，有待研究。經(jīng)貝那普利及健脾益腎活血方干預后，基底膜增厚及足突的融合在一定程度上減輕；Nephrin與Podocin表達平均熒光強度明顯高于模型組,且健脾益腎活血方明顯高于貝那普利組。有研究證實，ACEI上調(diào)Nephrin、Podocin表達是通過調(diào)節(jié)TRPC6影響裂孔隔膜實現(xiàn)的[14-15]，健脾益腎活血方上調(diào)Nephrin、Podocin表達的機制是否與此有關有待進一步研究。

綜上所述，健脾益腎活血方可以減少膜性腎病大鼠蛋白尿，能夠上調(diào)腎臟組織中Nephrin、Podocin蛋白表達，減輕足細胞裂孔隔膜損傷，維持其結構和功能的穩(wěn)定，從而起到保護腎臟功能的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。