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    超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中氯化膽堿含量

    2022-04-28 07:19:02馬愛平張忠一王愛卿劉嵩韓新安
    北方牧業(yè) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:膽堿氯化甲酸

    馬愛平,張忠一,★,王愛卿,劉嵩,韓新安

    (1.滄州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,河北 滄州 061000;2.河北省獸藥飼料工作總站,河北 石家莊 050035)

    氯化膽堿作為一種飼料添加劑, 對于動物來說,可預(yù)防動物肝臟、腎臟中的脂肪積累及其組織變性,可促進(jìn)氨基酸的再組合,可以用來加快動物的生長過程, 確保動物的脂肪新陳代謝和神經(jīng)功能正常,對于人類來說,可以提高氨基酸利用率,尤其是蛋氨酸在體內(nèi)的利用率;幫助脂肪維持液態(tài)形式, 并防止不需要的膽固醇或脂肪積聚在動脈、 肝臟和膀胱中。 對于植物來說, 可以促進(jìn)植物光合作用, 可用作飼料添加劑,對增加產(chǎn)量有明顯的效果。 常用作甘薯生根劑和塊根增大劑,比如用于玉米、馬鈴薯、蘿卜、洋蔥等增加產(chǎn)量,并廣泛用于果樹[1]。 目前常用的氯化膽堿測定方法有高氯酸非水滴定法、銀量法、定氮法、四苯硼鈉法、雷氏鹽法[2,3,4,5]和離子色譜法[6]等。 前5 種方法均是采用化學(xué)法間接測定氯化膽堿, 方法選擇性差, 干擾因素多; 檢測飼料中氯化膽堿的國標(biāo)方法有預(yù)混料中氯化膽堿的測定[6], 采用的仲裁方法為離子色譜檢測法。

    氯化膽堿化學(xué)式為C5H14ClNO,為白色的結(jié)晶粉末,極易吸濕。 熔點305℃,易溶于水和醇類,在堿性溶液中不穩(wěn)定,在甲酸水溶液中會解離為C5H14NO+離子和Cl-離子,如圖1 所示:

    圖1 氯化膽堿分子結(jié)構(gòu)

    本試驗根據(jù)氯化膽堿的性質(zhì), 對前處理步驟和儀器方法進(jìn)行創(chuàng)新。 采取水溶液提取,C18色譜柱分離,達(dá)到快速準(zhǔn)確,高效低耗的試驗?zāi)康模梢宰鳛橛行У臋z測手段。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    儀器:Waters UPLC Xevo TQ 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國沃特世公司)、色譜柱:BEH C18(50 毫米×內(nèi)徑2.1,粒徑1.7 微米)、北京永光明DZKW-D-2 電熱恒溫水浴鍋、 德國IKA KS501振蕩混勻器、100 毫升容量瓶, 梅特勒-托利多TLE204 天平(萬分之一)、粉碎機。

    試劑:乙腈(色譜純)、甲酸銨(色譜純)、水(應(yīng)符合GB/T 6682 一級水指標(biāo))。

    標(biāo)準(zhǔn)品:氯化膽堿(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量測試中心, 含量≥95%), 稱取氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)品0.1005g,置于100 毫升容量瓶中,用水溶解稀釋至刻度,搖勻,濃度為1 毫克/毫升。

    1.2 樣品處理

    飼料樣品用粉碎機粉碎, 通過0.42 毫米孔篩。 稱取1 克樣品(精確到0.0001 克),置于100毫升容量瓶中,加入約60 毫升水,在70℃的水浴鍋中加熱20 分鐘, 轉(zhuǎn)至振蕩器立即振蕩10分鐘,冷卻至室溫,用水定容至容量瓶刻度線,搖勻后過濾, 用初始流動相逐級稀釋至適當(dāng)濃度,過0.22 微米水系濾膜,上機測定。

    1.3 液相條件

    柱溫:40℃,進(jìn)樣室溫度:20℃,流速0.3 毫升/分鐘,進(jìn)樣量1 微升,流動相A:乙腈;流動相B:2 毫摩爾/升甲酸銨水溶液。液相梯度設(shè)置見表1。

    表1 液相梯度設(shè)置表

    1.4 質(zhì)譜條件

    電離模式:ESI+;掃描方式:MRM;離子源溫度150℃,脫溶劑溫度450℃,毛細(xì)管電壓0.5 千伏,錐孔電壓30 伏,碰撞能量15 電子伏特,碰撞氣為氬氣,流速50 升/小時,脫溶劑氣為氮氣,流速900 升/小時。

    1.5 結(jié)果計算

    上機測定后,根據(jù)外標(biāo)峰面積法定量。

    氯化膽堿含量計算公式:

    式中:

    X——試樣中氯化膽堿的含量, 單位為毫克/千克

    C——上機溶液的濃度,單位為納克/毫升

    V——定容試樣總體積,單位為毫升

    n——過濾后溶液的稀釋倍數(shù)

    m——稱量試樣的總質(zhì)量,單位為克

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    根據(jù)氯化膽堿的性質(zhì), 質(zhì)譜采用正離子監(jiān)測模式,選取C5H14NO+為母離子,分別對毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和離子對等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,在子離子掃描狀態(tài)下,選取碰撞后響應(yīng)最高的子離子為定量子離子, 次高的離子為定性子離子。 確定母離子104.1,定量子離子60.1,定性子離子45.0。

    2.2 色譜條件的優(yōu)化

    色譜條件的優(yōu)化主要考慮以下幾個方面。

    一是選擇最常用的C18 反相色譜柱, 雖然其對極性較強的化合物保留時間較短, 但是經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn),其能夠滿足實驗要求,且能夠縮短液相方法的時間。

    二是流動相的選擇,考察以下幾個方面。

    考察了水相中是否加入甲酸銨的區(qū)別。 上機溶液為1 納克/毫升時, 若水相中未加入甲酸銨,104.1>45.0 離子對峰型較差, 所以選擇水相中加入甲酸銨,濃度為2 毫摩爾/升。

    考察了水中是否加入1‰甲酸的區(qū)別。一般高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測時會在水相中加入甲酸,利于維持樣品在流動相中的電離狀態(tài),可以改善峰形。 但經(jīng)過實際對比實驗,水相中不加甲酸氯化膽堿信噪比明顯升高。 因此采用了水相中不加甲酸的方法。

    考察了甲醇-水、 乙腈-水兩種常見流動相體系對目標(biāo)化合物的影響。 在甲醇體系中初始有機相比例分別在2%、10%、20%、30%、40%的情況進(jìn)行了對比實驗。 發(fā)現(xiàn)隨著有機相比例的升高,氯化膽堿響應(yīng)值逐漸增高,信噪比未有明顯改善(見表2)。

    表2 甲醇-水體系中不同比例有機相對氯化膽堿檢測的影響

    在乙腈體系流動相中,發(fā)現(xiàn)相比甲醇體系,乙腈體系中氯化膽堿峰高也隨著有機相比例的提高而增高,信噪比明顯改善(見表3)。

    表3 乙腈-水體系中不同比例有機相對氯化膽堿檢測的影響

    綜合考慮,決定選擇乙腈體系,出峰時的有機相比例選擇40%(見圖2)。

    圖2 乙腈體系有機相比例為40%時離子色譜圖(1ng/毫升)

    2.3 前處理條件的優(yōu)化

    氯化膽堿易溶于水,熔點305℃,遇熱不易分解。 因此前處理時直接用水提取,使用水浴加熱提高溶解度,震蕩促進(jìn)氯化膽堿溶解,飼料中雜質(zhì)較多,使用定容后過濾的方法凈化,過濾時注意防止沉淀堵塞濾紙,必要時可更換新的濾紙過濾。

    2.4 線性范圍和定量限

    配制2、5、10、20、50 納克/毫升濃度基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)上機測定,保留時間為0.43 分鐘、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=856.956x+62.9086、相關(guān)系數(shù)r 為0.999739、 定量限為0.0001毫克/千克。 線性范圍能夠滿足檢測要求, 定量限遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法定量限。

    2.5 加標(biāo)回收率和精密度

    分別選取肉仔雞前期配合飼料、仔豬濃縮飼料、南美白對蝦配合飼料三種飼料進(jìn)行檢測, 所得數(shù)值為樣品含量; 在樣品中添加前述濃度為1 毫克/毫升的氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 毫升, 按照前處理步驟檢測,所得數(shù)值為樣品添加含量。 重復(fù)平行測定6 次得出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率,從表4 可以看出,試驗重復(fù)性和回收率均取得較好效果。

    表4 加標(biāo)回收率和RSD%

    3 結(jié)論

    實驗建立了利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中氯化膽堿的檢測方法,該方法通過比較不同流動相對檢測結(jié)果的影響, 優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù), 可以快速簡便地測定配合飼料和濃縮飼料中氯化膽堿的含量,定量準(zhǔn)確,回收率滿足分析要求。 本方法具有重復(fù)實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定、線性關(guān)系良好、定量限遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)點,適合于配合飼料和濃縮飼料的快速檢測, 也為飼料添加劑氯化膽堿檢測提供了新方法。

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