超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定漁業(yè)水環(huán)境中七種氟喹諾酮類藥物含量

高磊，王鐘強(qiáng)，覃東立，陳中祥，吳松，湯施展，黃曉麗，孫承宇，黃麗,6，郝其睿，白淑艷，杜寧寧，李晨輝，王鵬

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150070;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141;4.河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，河北 石家莊 050021；5.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030;6.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006）

近年來隨著我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)的迅猛發(fā)展，抗生素藥物的使用規(guī)模也在隨之增加[1]。氟喹諾酮類藥物（FQs）對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中革蘭氏陰性菌包括綠膿桿菌等，革蘭氏陽性菌包括鏈球菌、葡萄球菌等均有較強(qiáng)活性[2]，具有高效、廣譜、價(jià)格低廉、抗菌譜廣等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]，目前已成為使用量較大的抗生素藥物之一[4]。然而FQs 卻難以被生物吸收或代謝，在自然界不易降解[5]。據(jù)研究表明，F(xiàn)Qs 被動(dòng)物體吸收后，僅有少部分的FQs 會(huì)殘留在動(dòng)物組織內(nèi)，大部分會(huì)通過糞便或尿液等途徑排出體外，最終進(jìn)入到生態(tài)環(huán)境中，造成抗生素藥物污染[6,7]。并且原藥及其代謝產(chǎn)物會(huì)隨食物鏈不斷富集，最終影響與危害人體健康。綜上所述，建立一種快速準(zhǔn)確高效的檢測(cè)漁業(yè)水環(huán)境中的FQs 殘留的方法是十分有意義的。

固相萃?。⊿PE）因富集能力優(yōu)良而被應(yīng)用于不同的前處理過程[8,9]，但由于部分商業(yè)化固相萃取小柱的價(jià)格其應(yīng)用受到相應(yīng)的限制。磁性固相萃?。╩agnetic SPE，MSPE）是一種新型固相萃取技術(shù)，其采用磁性材料作為吸附載體，原理是將磁性吸附材料直接與待測(cè)樣品溶液混合，通過振蕩吸附等手段使得吸附材料和待測(cè)物充分接觸并達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附平衡狀態(tài)，再通過外部磁場(chǎng)作用將吸附了待測(cè)物的吸附材料與基質(zhì)分離開，再采取洗脫等步驟解析待測(cè)物，達(dá)到富集目標(biāo)待測(cè)物的目的。MSPE 技術(shù)萃取效率高、步驟簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、可批量處理大批次樣品及可回收利用多次，已成為當(dāng)前環(huán)境及食品安全等多個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)如甘藍(lán)中農(nóng)藥檢測(cè)[10]，蜂蜜[11]、動(dòng)物組織[12]和人體血液[13]中抗生素藥物的檢測(cè)等。

常用儀器檢測(cè)法檢測(cè)抗生素的殘留量，如高效液相色譜（HPLC）法[14-17]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[18-20]等。由于HPLC 法的定性手段為保留時(shí)間，當(dāng)基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜時(shí)會(huì)由于待測(cè)物與雜質(zhì)同流出導(dǎo)致目標(biāo)定性不準(zhǔn)確，造成假陽性。而采用了三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的LC-MS/MS法不僅僅通過保留時(shí)間，結(jié)合兩對(duì)離子對(duì)及其比例，可以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的定性，還具有更高的準(zhǔn)確度以及靈敏度，能夠滿足水環(huán)境中痕量抗生素藥物殘留檢測(cè)的要求，目前為多組分檢測(cè)的主要分析手段[21-24]。

本研究擬開發(fā)一種磁性萃取技術(shù)，以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)養(yǎng)殖水體中FQs 的殘留。選用碳納米管作為載體，使用制備后具磁性的碳納米管（MCNTs）作為漁業(yè)水環(huán)境中FQs 的吸附材料，結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立漁業(yè)水環(huán)境中多種FQs 的分離方法，最終建立水體中FQs 的殘留檢測(cè)方法。本方法具有靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低、可同步批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（ACQUITY UPLC-XEVO TQs，含ESI 電離源，美國(guó)Waters 公司）；空氣壓縮機(jī)（日立公司）；氮?dú)獍l(fā)生器（PEAK 公司）；氮吹儀（N-EVAPTM111，美國(guó)Organomation 公司）；超聲波清洗機(jī)（KQ-700E，昆山超聲儀器有限公司）；純水器（美國(guó)Millipore 公司）；渦旋混勻器（德國(guó)IKA 公司）；水浴鍋；烘箱等。乙腈、乙醇、甲酸、碳納米管（CNTs）、甲醇、氯化鐵、氯化亞鐵及氨水等試劑耗材購(gòu)置于上海安譜實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

恩諾沙星（EFX）、環(huán)丙沙星（CFX），諾氟沙星（NFX）、培氟沙星（PEF）、洛美沙星（LOM）、氧氟沙星（OFX）、氟羅沙星（FLX）及三種內(nèi)標(biāo)NFX-D5、CFX-D8、EFX-D5 抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。準(zhǔn)確稱取一定量（10 mg）各標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲酸0.2 mL，再加入甲醇超聲溶解，定容于10 mL 容量瓶中，配制成1 mg/mL 的FQs 單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-18℃保存。儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，配制成各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

磁性碳納米管（MCNTs）根據(jù)本課題組已建立的合成方法做適當(dāng)修改[25]。首先將CNTs 進(jìn)行純化，洗滌。進(jìn)一步采用二價(jià)鐵，三價(jià)鐵在堿性條件下合成MCNTs。再經(jīng)超純水，無水乙醇分別清洗，烘干備用。取100 mL 水樣過濾紙，收集濾液置于250 mL燒杯中。首先使用冰醋酸或氨水將過濾好的水樣pH 調(diào)節(jié)到7，然后加入MCNTs 30 mg，渦旋30 s，振蕩提取20 min。超強(qiáng)磁鐵將MCNTs 吸附至底層，棄掉上層水樣，而后每次使用1 mL 甲醇洗脫MCNTs，共計(jì)三次，磁性分離洗脫液，將洗脫液置于40℃下氮?dú)獯抵两?，加? mL 液相色譜初始流動(dòng)相后渦旋30 s 混勻，過0.22 μm 有機(jī)相過濾膜得到上機(jī)液。

1.4 色譜質(zhì)譜儀器條件

色譜相關(guān)條件如下：流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相A 為甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1000），流動(dòng)相B 為乙腈；洗脫梯度程序?yàn)椋?～2.0 min（保持95%A，5%B）；2.0～4.2 min（95%～5%A，5%～95%B）；4.2～6.4 min（保持5%A，95%B）；6.4～6.5 min（5%～95%A，95%～5%B）；6.5～8.0 min（保持95%A～5%B），其中流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液（V甲酸∶V水=1∶1 000），流動(dòng)相B 為乙腈。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1×50.0 mm；柱溫為30℃。

質(zhì)譜相關(guān)條件如下：電噴霧離子源（ESI+）；毛細(xì)管電壓，3.0 kV；離子源溫度，150℃；去溶劑溫度，450℃；偏轉(zhuǎn)電壓，30 V；去溶劑氣流量，800 L/Hr；錐孔氣，250 L/Hr；錐孔電壓，20 V；碰撞氣流量，0.14mL/min；選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；FQs 的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式各參數(shù)如表1 所示。以保留時(shí)間、離子對(duì)及離子對(duì)豐度比定性。定量采取內(nèi)標(biāo)法定量，其中NFX、OFX、FLX、PEF 選用NFX-D5 定量，CFX、LOM選取CFX-D8 定量，EFX 選取EFX-D5 定量。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下7 種FQs 的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters of seven fluoroquinolone antibiotics in multiple reaction monitoring mode

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化及確定

根據(jù)經(jīng)典的色譜塔板理論，使用1.7 μm 粒徑的5 cm 超高效液相色譜柱，相同長(zhǎng)度的色譜柱會(huì)比傳統(tǒng)的HPLC 有更好的柱效，并且在更短的時(shí)間內(nèi)完成多組分物質(zhì)的分離，得到更尖銳的色譜峰。優(yōu)化LC-MS/MS 的MRM 方法和7 種氟喹諾酮類抗生素的質(zhì)譜條件。配置每種FQs 物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)溶液，采用Combine 方式得到其母離子及子離子的質(zhì)核比。進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。在MS SCAN 模式下得到待測(cè)物的母離子，然后在Daughter 模式下掃描得到相應(yīng)子離子，找到兩個(gè)豐度最高的子離子，其中一個(gè)母離子和一個(gè)子離子組成一對(duì)特征離子對(duì)。根據(jù)歐盟對(duì)化合物的定性要求，一般定性采用兩對(duì)特征離子對(duì)，其中一對(duì)作為定量離子。為達(dá)到質(zhì)譜的最佳靈敏度通過Combine 模式優(yōu)化碰撞能量，以不同的碰撞能量掃描目標(biāo)物的子離子，根據(jù)其強(qiáng)度的響應(yīng)變化，得到最大響應(yīng)值時(shí)的儀器參數(shù)。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 MCNTs 質(zhì)量對(duì)回收率的影響

影響萃取最終回收率效率的因素有很多，其中MCNTs 的質(zhì)量是關(guān)鍵因素之一。本實(shí)驗(yàn)在100 mL水樣中分別加入10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg磁性材料，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3 次平行，取平均值作圖（圖1-A），當(dāng)MCNTs 添加量小于30 mg 時(shí)，7 種FQs 回收率同MCNTs 添加量成正相關(guān)；當(dāng)添加量大于30 mg 后，F(xiàn)Qs 回收率趨于穩(wěn)定。因此最終選擇向100 mL 水樣中添加30 mg MCNTs 最為最優(yōu)條件。

2.2.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

在磁性固相萃取的諸多影響因素中，萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響較為關(guān)鍵。此次實(shí)驗(yàn)考察了5 min、10 min、20 min、30 min、40 min 等不同萃取條件下回收率的變化規(guī)律，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值作圖（圖1-B），當(dāng)萃取時(shí)間小于20 min時(shí)，吸附效果與萃取時(shí)間呈正相關(guān)，回收率提高；當(dāng)萃取時(shí)間大于20 min 時(shí)，回收率變化不大，說明已達(dá)到萃取飽和狀態(tài)。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇20 min 作為萃取時(shí)間。

圖1 萃取劑添加量（A）、萃取時(shí)間（B）及使用次數(shù)（C）對(duì)FQs 回收率的影響Fig.1 The influence of amount of extractant（A）,extraction time（B）and frequency of use（C）on recovery of the fluoroquinolone antibiotics

2.2.3 洗脫劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取丙酮、甲醇和乙腈三種洗脫溶劑進(jìn)行測(cè)試[25]。超聲洗脫相對(duì)于渦旋洗脫會(huì)有更高的洗脫效率，選用3 mL 丙酮、3 mL 甲醇、3 mL 乙腈分別作為洗脫劑洗脫一次（超聲30 s），發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫劑洗脫效果良好，價(jià)格較低。另外，選取合適的洗脫體積會(huì)減少后續(xù)氮?dú)獯蹈伤璧臅r(shí)間，實(shí)驗(yàn)選用了1 mL、3 mL 及5 mL 等不同體積的洗脫劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)洗脫劑為1 mL 甲醇，每次超聲30 s，重復(fù)上述操作2 次，每個(gè)組份的回收率均可以達(dá)到80%以上。故最終選取甲醇1 mL 作為洗脫劑。

2.2.4 MCNTs 的重復(fù)使用

磁性分離后，將MCNTs 回收，重新干燥待用。并重新使用回收干燥后的MCNTs 作為吸附材料重新處理樣品，并在最優(yōu)條件下測(cè)定其回收率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值作圖（圖1-C），使用MCNTs 第3 次時(shí)，待測(cè)物回收率依然可以達(dá)到75.67%以上。故此吸附材料可重復(fù)使用至少2 次。

2.3 方法線性范圍及檢出限

分別配制不同濃度梯度的FQs 標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL，按照上述優(yōu)化后得到的最佳前處理?xiàng)l件凈化富集樣品，最后采用UPLC-MS/MS 定性定量分析。結(jié)果顯示，在樣品質(zhì)量濃度在20～1 000 ng/L 范圍時(shí)得到了很好的線性，其相關(guān)系數(shù)r 均在0.995～1 之間，檢出限為10.0 ng/L。為了考察方法的準(zhǔn)確性，選取了低濃度（10 ng/L）、中濃度（100 ng/L）和高濃度（1 000 ng/L）3 個(gè)不同濃度對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，且每個(gè)濃度做三次平行試驗(yàn)，以純凈水的加標(biāo)回收率進(jìn)行校正，測(cè)定加標(biāo)回收率，將高濃度質(zhì)控樣品連續(xù)處理三天計(jì)算回收率以得到日間精密度。七種FQs 的回收率均在76.70%～98.16%之間，日內(nèi)精密度在2.21%～5.39%之間，日間精密度在3.48%～6.21%之間（表2）。

表2 七種FQs 的加標(biāo)回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the fluoroquinolone antibiotics in fishery water

2.4 實(shí)際樣品分析

實(shí)際水樣取自4 個(gè)位于哈爾濱周邊的養(yǎng)殖池塘（各1 個(gè)樣品）、哈爾濱市道里區(qū)室內(nèi)自來水（1 個(gè)樣品）和某品牌瓶裝礦泉水（1 個(gè)樣品），共計(jì)6 個(gè)樣品。經(jīng)上述前處理過程后分析，發(fā)現(xiàn)哈爾濱一處池塘有恩諾沙星（EFX）和環(huán)丙沙星（CFX）的殘留，其EFX 含量為90.62 ng/L，CFX 含量為27.51 ng/L（圖2）。

圖2 空白（A）、標(biāo)準(zhǔn)樣品（B）和實(shí)際樣品（C）色譜圖，其中箭頭指示部分為EFX 和CFX 的兩個(gè)定性離子對(duì)的放大色譜圖Fig.2 The total ion chromatogram of（A）the blank sample;（B）the standard fluoroquinolone antibiotics;and（C）one real sample,where the arrows indicated the extraction ion chromatogram

3 討論

本方法相比于采用商業(yè)固相萃取柱方式前處理樣品，可以降低實(shí)驗(yàn)成本[23]。并且較先前課題組建立的篩查方法本研究得到了更好的定量限，使定量限進(jìn)一步降低1.65 倍[26]。在儀器分析階段，采用液相色譜作為分離單元分離多組份時(shí)往往需需要20 min 以上；本研究采用超高效液相色譜可以將分析時(shí)間控制在8 min，縮短為分析時(shí)間一半以上，同時(shí)每分析一個(gè)樣品僅需要不到1.03 mL 有機(jī)流動(dòng)相，每個(gè)樣品可減少消耗1.6 mL 有機(jī)溶劑[27]。在處理樣品時(shí)可以采用同步振蕩方式處理大批量漁業(yè)水環(huán)境樣品，提高檢測(cè)效率，具有操作簡(jiǎn)單用時(shí)短、環(huán)保安全等優(yōu)點(diǎn)[25]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了一種新型分離萃取漁水域中七種氟喹諾酮類藥物的M-SPE 方法，采用UPLC-MS/MS 對(duì)FQs 定性定量分析。針對(duì)色譜質(zhì)譜條件、吸附材料的質(zhì)量、萃取時(shí)間、洗脫劑的選擇等條件進(jìn)行了優(yōu)化，所分析的諾氟沙星（NFX）、環(huán)丙沙星（CFX）、培氟沙星（PEF），洛美沙星（LOM）、恩諾沙星（EFX）、氧氟沙星（OFX）、氟羅沙星（FLX）七種FQs 在20～1 000 ng/L 表現(xiàn)出良好的線性，具有實(shí)驗(yàn)成本低、檢測(cè)靈敏、儀器分析時(shí)間短、節(jié)約有機(jī)溶劑消耗及可批量處理等優(yōu)勢(shì)。未來亦可制作成商品化樣機(jī)，應(yīng)用于實(shí)際漁業(yè)水環(huán)境樣品的現(xiàn)場(chǎng)處理，以解決現(xiàn)場(chǎng)快檢技術(shù)中樣品前處理的瓶頸，具有很好的應(yīng)用前景。