固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水中痕量苯甲地那銨

劉思思，陳長(zhǎng)二，陳仕保，傅新龍，李金玲，應(yīng)光國(guó)

廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)環(huán)境研究院/環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 511436

苯甲地那銨又名苦精，是一種目前世界上已知的最苦的人工合成化學(xué)品。由于其強(qiáng)烈的苦味和較弱的毒性，苯甲地那銨被廣泛添加到家庭日用品、工業(yè)乙醇、防凍劑和動(dòng)物驅(qū)散劑中[1-3]。苯甲地那銨在環(huán)境中既不會(huì)發(fā)生水解，也很難生物降解[4-6]，非常穩(wěn)定。此外，苯甲地那銨對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)具有中等急性毒性(經(jīng)口半致死劑量為196～841 mg/kg)，對(duì)魚(yú)類(lèi)的急性毒性較弱(96 h半致死濃度大于1 000 mg/L)[7-8]。因此，苯甲地那銨被認(rèn)定為一種潛在的PMT (環(huán)境持久性、高遷移性和毒性) 類(lèi)物質(zhì)[9]。雖然苯甲地那銨用途廣泛且具有環(huán)境持久性，但其直到2017年才在德國(guó)污水處理廠中被首次檢出，檢出頻率高達(dá)100%，最高質(zhì)量濃度為341 ng/L[10-11]。目前，這種新興環(huán)境微污染物在全球水環(huán)境中的殘留水平和分布特征仍不清楚。

建立可靠的痕量苯甲地那銨檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)測(cè)其環(huán)境水平和了解其環(huán)境遷移行為具有重要意義。目前，苯甲地那銨的主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法[12]、紫外可見(jiàn)分光光度法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]、液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法[15]等。但這些檢測(cè)方法主要適用于各種產(chǎn)品中高濃度的苯甲地那銨檢測(cè)(μg/L ～ mg/L)，并不適用于環(huán)境水體中痕量苯甲地那銨的檢測(cè)( ng/L)。本文通過(guò)優(yōu)化關(guān)鍵前處理參數(shù)，建立了水中痕量苯甲地那銨的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，系統(tǒng)考察了該方法的準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限以及線性范圍，為監(jiān)測(cè)環(huán)境水體中苯甲地那銨提供了有力的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

苯甲地那銨(純度 > 98%，DB)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，苯甲地那銨-D5(芐基-2,3,4,5,6氘取代，純度 > 98%)購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。甲醇(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merk公司；甲酸(色譜純)和氨水(氨體積分?jǐn)?shù) ≥ 25%，色譜純)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Oasis HLB固相萃取小柱(200 mg，3 mL)購(gòu)自美國(guó)Waters公司，混合型陽(yáng)離子交換(MCX)小柱(200 mg，3 mL)和弱陽(yáng)離子交換(WCX)小柱(200 mg，3 mL)均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司，純水和超純水由法國(guó)Elga水純化系統(tǒng)(威立雅)提供。

固相萃取真空裝置(16位，上海安譜公司)；氮吹濃縮裝置(MTN-2800D，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC Acquity?-Xevo TQS，美國(guó)Waters公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.001 0 g，用甲醇溶解并定容到10 mL的棕色容量瓶中，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在-18 ℃下避光保存(6個(gè)月內(nèi)使用)。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇定容至10 mL，配制成已知濃度的中間標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用0.1% (體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(初始流動(dòng)相)稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

200 mL水樣過(guò)0.7 μm 孔徑玻璃纖維(GF/F)濾膜去除懸浮顆粒物后，以1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8以上。采用WCX固相萃取小柱(200 mg，3 mL)來(lái)富集水樣。上樣前，SPE小柱先分別以3 mL甲醇和3 mL純水進(jìn)行活化和平衡。上樣流速控制在2 ～ 3 mL/min。采用3 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的氨水水溶液進(jìn)行淋洗，然后抽干30 min。最后，以5 mL 2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸-甲醇洗脫SPE小柱上的目標(biāo)物，收集于氮吹管中。目標(biāo)物在50 ℃下氮吹至近干，以1 mL初始流動(dòng)相重溶待測(cè)。

1.4 儀器分析

色譜柱為ACUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；0.1% (體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programme

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧離子源(ESI+)；分析物在正離子掃描下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)分析(圖1)；優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。其他優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氣流量為800 L/h；錐孔反吹氣流量為150 L/h；碰撞氣流量為0.17 mL/min；霧化氣壓力為0.7 MPa。

圖1 50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖(EIC)Fig.1 Extracted ion chromatograms (EIC) ofDB standard solution at 50 μg/L

表2 DB及其內(nèi)標(biāo)DB-D5質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of DB and theinternal standard,DB-D5

1.5 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

所有玻璃器皿用自來(lái)水超聲清洗30 min，用自來(lái)水清洗干凈后，再用純水洗3次，烘干后甲醇洗2次，待溶劑揮發(fā)完全后，置于馬弗爐中于450 ℃下燒3 h，自然冷卻后取出待用。

所有樣品在提取前添加回收率指示物標(biāo)樣(DB-D5)，以指示整個(gè)樣品前處理過(guò)程的回收率。同時(shí)進(jìn)行方法空白、基質(zhì)加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)平行樣及樣品平行樣的測(cè)定，以進(jìn)行質(zhì)量控制與質(zhì)量保證措施。

在每批樣品進(jìn)行儀器分析前，用空白溶劑和已知濃度標(biāo)樣檢查儀器的靈敏度和穩(wěn)定性，同一標(biāo)樣測(cè)定的誤差小于20%方可進(jìn)行樣品測(cè)定，否則對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試。

根據(jù)歐盟有關(guān)違禁藥物檢測(cè)的條例規(guī)定(2002/657/EC)，為了保證目標(biāo)化合物識(shí)別的準(zhǔn)確性，采用如下2個(gè)標(biāo)準(zhǔn):第一，樣品中色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間的相對(duì)偏差應(yīng)在±2.5%以內(nèi)；第二，定性離子的相對(duì)豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的定性離子相對(duì)豐度比的相對(duì)偏差(K)不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在該目標(biāo)物。

表3 定性離子相對(duì)豐度比的最大允許相對(duì)偏差Table 3 Maximum tolerance for the relative deviationsof the relative abundance of qualitative ions

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件比較

通過(guò)優(yōu)化固相萃取過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)(SPE柱類(lèi)型、水樣pH和洗脫溶劑種類(lèi))，來(lái)確定最佳SPE條件。

2.1.1 SPE柱類(lèi)型選擇

由于DB屬于離子型有機(jī)物，其主要母體結(jié)構(gòu)帶正電。因此比較了2種陽(yáng)離子交換機(jī)理的SPE柱(WCX和MCX)以及一種通用型SPE柱(HLB)，并控制上樣pH在8左右，洗脫劑為2%甲酸-甲醇。從結(jié)果來(lái)看，WCX柱(110%±5.6%)和MCX柱的提取效率(106%±4.5%)要明顯高于HLB柱的提取效率(75% ± 3.1%)?？紤]到實(shí)際樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)量濃度存在一定的抑制作用(圖4)，為部分補(bǔ)償實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中的基質(zhì)抑制效應(yīng)，最終選擇WCX柱來(lái)富集水樣。

2.1.2 水樣pH優(yōu)化

水樣pH可以決定離子型有機(jī)物的帶電狀態(tài)和賦存形態(tài)，也可以影響SPE吸附劑的帶電狀態(tài)。比較pH 分別為 6、8和10條件下采用WCX柱富集和2%甲酸-甲醇洗脫時(shí)的回收率(圖2)，可以看出水樣pH=6時(shí)加標(biāo)回收率為147%±19%，明顯超過(guò)100%；而水樣pH為8 ～ 10時(shí)對(duì)回收率結(jié)果的影響并不顯著(P> 0.05,單因素方差分析)，加標(biāo)回收均能達(dá)到100%～110%。因此，最終選擇將上樣pH調(diào)至8以上。

圖2 不同提取條件下加標(biāo)回收率比較Fig.2 Spiked recoveries of DB underdifferent SPE conditions

2.1.3 洗脫溶劑選擇

采用WCX柱進(jìn)行洗脫溶劑選擇實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中水樣pH調(diào)至8左右。洗脫溶劑對(duì)比了甲醇、2%甲酸-甲醇和2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)氨水-甲醇。圖2中表明，甲醇洗脫效率僅為25%±4.5% (n=3)；而往甲醇中加入2%甲酸或者氨水均能顯著提高DB的洗脫效率，但2%氨水-甲醇的洗脫效率遠(yuǎn)大于100%，說(shuō)明可能更多的基質(zhì)被同時(shí)洗脫下來(lái)。因此，最終選擇2%甲酸-甲醇作為最佳洗脫溶劑。

2.2 準(zhǔn)確度、精密度與基質(zhì)效應(yīng)

2.2.1 準(zhǔn)確度

方法準(zhǔn)確度是指使用該方法的測(cè)量結(jié)果與真實(shí)值的接近程度，一般用回收率表示。從圖3可以看出，純水中DB在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率為97%～105%；珠江河水中DB在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率為89%～119%?；厥章示?0%～120%之間，表明方法準(zhǔn)確度較高，可以高效富集環(huán)境水體中的DB。

圖3 純水和珠江河水中不同加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.3 Spiked recoveries and standarddeviations of DB in pure water and watersamples from the Pearl River atdifferent spiked levels

2.2.2 精確度

方法精密度是指在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)同一個(gè)均質(zhì)樣品多次取樣分析所測(cè)得結(jié)果之間的接近程度。一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，%)表示。純水和珠江河水中不同加標(biāo)濃度下測(cè)量結(jié)果的RSD均小于7%，說(shuō)明該方法的精密度較高。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)指樣品中被分析物以外的組分。基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。基質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響可以通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)(ME)來(lái)衡量[16]。污水處理廠進(jìn)水和珠江河水樣品中不同加標(biāo)濃度下基質(zhì)效應(yīng)如圖4所示。

從圖4可以看出，DB在污水處理廠進(jìn)水和河水樣品中的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)分別為-23.8%～-12.5%和-16.5% ～ -8.5%。ME均為負(fù)數(shù)，說(shuō)明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。污水處理廠進(jìn)水樣品的基質(zhì)抑制效應(yīng)相比河水樣品更大，尤其是在較低濃度時(shí)，可能是由于污水處理廠進(jìn)水基質(zhì)相比河水更加復(fù)雜。而河水樣品的ME均小于20%，說(shuō)明河水樣品對(duì)該方法的基質(zhì)干擾較小。

圖4 污水處理廠進(jìn)水和珠江河水樣品中不同加標(biāo)濃度下基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of DB in water samplesfrom the influent of a WWTP and the PearlRiver at different spiked levels

2.3 方法檢出限與線性范圍

方法檢出限是指在特定基質(zhì)中對(duì)被分析物能進(jìn)行可靠確認(rèn)和定量的最低濃度，且其測(cè)定結(jié)果應(yīng)有不低于90%的準(zhǔn)確度。通過(guò)往7份200 mL空白水樣中加入0.1 ng目標(biāo)物，經(jīng)過(guò)全過(guò)程分析，計(jì)算得到方法檢出限(MDL)[17]為0.07 ng/L，可滿足環(huán)境水體中痕量苯甲地那銨的檢測(cè)。

通過(guò)測(cè)量0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/L 9個(gè)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，建立目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為1 μg/L)。從圖5可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r為0.999，說(shuō)明DB在該濃度范圍內(nèi)有很好的線性。當(dāng)DB質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí)，峰高為1.2 × 108，接近檢測(cè)器的飽和閾值；而當(dāng)DB質(zhì)量濃度增加至100 μg/L時(shí)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)已經(jīng)發(fā)生飽和。如果樣品中DB的測(cè)量值超過(guò)50 μg/L時(shí)，可能需要對(duì)樣品濃度進(jìn)行稀釋后重新測(cè)量。因此，DB的線性范圍為0.01 ～ 50 μg/L。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for DB

2.4 環(huán)境水樣測(cè)定

采用該方法測(cè)定了3份采集于珠江廣州城區(qū)段水樣中DB的濃度。結(jié)果表明DB在3份水樣中均被檢出，3次全過(guò)程重復(fù)分析結(jié)果分別為(2.8±0.4)、(5.7±0.2)、(4.7±0.2)ng/L。在顯著性水平α=0.05時(shí)計(jì)算的F值均小于臨界值，說(shuō)明3組測(cè)量結(jié)果的精密度之間無(wú)顯著性差異。污水處理廠可能是環(huán)境中DB的主要來(lái)源[11]。因此，未來(lái)有必要研究DB在污水處理廠中的分布特征和去除情況。

3 結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水中DB的方法，該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，基質(zhì)效應(yīng)較小，方法檢出限可達(dá)痕量級(jí)別，可用于準(zhǔn)確定量環(huán)境水體中的痕量DB。