病原宏基因組測序?qū)Ψ尾扛腥静≡w檢測價(jià)值以及影響因素分析

李江蕾，施 勇，任鴻芋，劉玲艷，樊亞雄

(楚雄州人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南 楚雄 675000)

肺部感染是常見的呼吸道感染性疾病，病原體多為細(xì)菌、病毒以及真菌。病原體的檢測是針對性治療的必要前提，但傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)法陽性率低，特別是在進(jìn)行取樣之前已經(jīng)應(yīng)用廣譜抗生素進(jìn)行治療的患者。病原宏基因組測序(metagenornic next-generation sequencing，mNGS)，是通過對DNA/RNA的非靶向測序技術(shù)，可同時(shí)檢測病毒、細(xì)菌、真菌以及寄生蟲的序列，使病原體鑒定模式發(fā)生了革命性的變化，目前已在臨床上開展應(yīng)用[1]。最新臨床研究顯示，mNGS在肺部感染病原體檢測中診斷準(zhǔn)確性較高[2，3]。2020年病原學(xué)診斷專家共識中，肯定了mNGS在感染性疾病診斷領(lǐng)域中的優(yōu)勢[4]。本院自引進(jìn)mNGS以后，已經(jīng)完成對多名肺部感染患者病原體檢測，本研究就mNGS的診斷效率以及影響因素做一分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月-2021年6月在本院住院并送檢mNGS的肺部感染者 19 例，男14例，女5例，年齡56～72歲，平均年齡(65.82±8.77)歲。送檢前化驗(yàn)結(jié)果為白細(xì)胞(12.10±6.26)×109/L；中性粒細(xì)胞(89.38±11.52)%；C反應(yīng)蛋白(8.29±4.15)mg/L；降鈣素原(2.26±1.88)ng/mL。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、肺部影像學(xué)檢查等診斷為肺部感染；(2)送檢標(biāo)本符合《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識(2017)》的肺泡灌洗液標(biāo)本[5]。(3)對肺泡灌洗和mNGS知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非感染性疾??；(2)無配對的傳統(tǒng)培養(yǎng)；(3)因身體原因無法進(jìn)行支氣管鏡檢查以及肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)；(4)收集的樣本未通過質(zhì)量控制。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

入組的患者入院后收集患者痰液5 mL，行肺泡灌洗后收集10 mL回收液體。通過血液途徑檢測的患者在入院后，抽取雙側(cè)靜脈血共2份血液標(biāo)本送檢，高熱的患者于熱峰前30 min采集。同時(shí)將痰液、肺泡灌洗液、外周血用于mNGS檢測以及院內(nèi)病原學(xué)培養(yǎng)。

1.2.2 病原體培養(yǎng)與鑒定

按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第 4 版)[6]相關(guān)流程操作，將樣本分別接種于血瓊脂平板、巧克力平板行細(xì)菌培養(yǎng)，接種于念珠菌顯色平板、沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)平板行真菌培養(yǎng)，分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(MGIT960)進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本應(yīng)用布魯克質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

1.2.3 高通量測序

根據(jù)11ANaHlp Micr0 DNAKit[DP316，Tiagen]試劑盒步驟提取核酸。使用 Nextera XT DNA 樣品制備試劑盒(MACHEREY-NAGEL)對 DNA 或 cDNA 制備文庫。Agilent 2100(Agilent)質(zhì)控，使用 Qubit dsDNA/RNA HS試劑盒定量文庫濃度。Nextseq 550測序儀(Illumina)進(jìn)行高通量測序。得出數(shù)據(jù)經(jīng)FastQC 軟件分析比對。

1.3 mNGS檢測陽性標(biāo)準(zhǔn)[7]

在患者臨床資料基礎(chǔ)上，若符合以下任一條則認(rèn)為陽性：(1)病毒RPM((Reads Per Million reads，每百萬條序列比對到物種的序列數(shù)目)≥3，逆轉(zhuǎn)錄病毒RPM≥1000；(2)真菌RPM≥5；(3)胞內(nèi)菌：如結(jié)核分枝桿菌RPM≥1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2種檢測方法陽性、陰性檢出結(jié)果對比

19例患者中，陽性標(biāo)本14例，陽性率73.68%；培養(yǎng)陽性標(biāo)本為9例，陽性率為47.37%。其中雙陽性標(biāo)本共9例(47.37%)，雙陰性共5例(26.32%)。mNGS法檢測出陽性率明顯高于傳統(tǒng)方法(P<0.05)，見表1。

2.2 2種檢測手段檢測出病原體情況

2.2.1 mNGS和傳統(tǒng)檢測方法檢出病原體種類對比

mNGS方法檢測出的病原體為2種混合感染的比例最高，占47.37%，而傳統(tǒng)方法僅檢測出一種病原體。2種及以上病原體檢出率mNGS要明顯高于傳統(tǒng)方法(52.63% vs 0，P<0.05)，見表2。

表2 2種方法檢測出病原體種類對比[n(%)]

2.2.2 mNGS和傳統(tǒng)檢測方法分離出的病原體

銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌最為常見(3/25)，其次為人類皰疹病毒4型和7型、細(xì)環(huán)病毒、星座鏈球菌、肺炎鏈球菌、白色念珠菌(均為2/25)，見表3。

表3 2種檢測手段檢測出病原體株數(shù)(株)

2.3 mNGS檢測陽性影響因素單因素分析

mNGS陽性患者在檢測前使用過抗生素、白細(xì)胞數(shù)量、CRP水平等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

圖1 mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測的病原體分布

表4 mNGS檢測陽性影響因素單因素分析

2.4 mNGS檢測陽性影響因素多因素分析

以檢測前使用過抗生素、白細(xì)胞數(shù)量、CRP水平納入統(tǒng)計(jì)，經(jīng)Logistic多因素回歸分析得出，3者均非mNGS檢測陽性的影響因素(P>0.05)，見表5。

表5 mNGS檢測陽性影響因素多因素分析

3 討論

傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測方法受到標(biāo)本污染、抗生素使用等因素影響，陽性率低、靈敏度特異度不高、時(shí)效性不佳。mNGS作為新一代技術(shù)，具有高通量和快速檢測等特點(diǎn)。目前報(bào)道m(xù)NGS臨床臨床符合率在65%～100%不等[8～10]。本試驗(yàn)搜集了本院近半年應(yīng)用mNGS進(jìn)行病原體檢測的肺部感染的患者19例，其中[1]14例檢測出病原體，陽性檢出率為73.68%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法。本mNGS結(jié)果還顯示，52.63%的感染為混合感染，而傳統(tǒng)方法僅能檢測出單一病原體。

Li等[11]應(yīng)用mNGS對肺炎患者致病菌分析顯示，最常見的為不動桿菌屬，韋榮氏菌屬，假單胞菌屬和羅氏菌屬以及耶氏肺孢子菌。Xie 等[12]的研究則發(fā)現(xiàn)肺部灌洗液mNGS檢測下最常見的為鮑曼不動桿菌，其次為銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球。本研究對入選的19例患者mNGS檢測結(jié)果顯示致病菌為銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、人類皰疹病毒4型、人類皰疹病毒7型、細(xì)環(huán)病毒、星座鏈球菌、肺炎鏈球菌和白色念球菌。不同研究的病原譜差異主要是因?yàn)椋?1)收集的患者所處的環(huán)境不一樣；(2)入選患者感染程度不一樣，本研究入選的患者多為輕癥為主，而上述研究的患者多為重癥肺炎。

早期廣譜抗生素或預(yù)防性抗菌藥物的使用會阻礙傳統(tǒng)病原體的培養(yǎng)。Miao Q等[13]將感染患者分為已用抗生素組和未用抗生素組，并對比2組應(yīng)用mNGS和傳統(tǒng)方法的檢出率，結(jié)果顯示應(yīng)用mNGS法差異不顯著，而傳統(tǒng)方法2組差異較大，提示抗生素對mNGS影響較小。本研究通過單因素以及多因素分析顯示，早期應(yīng)用抗生素并不是影響mNGS病原體檢出率的因素，與上述研究結(jié)論一致。

綜上可見，mNGS對肺部感染病原體檢出率高，且受抗生素的影響相對培養(yǎng)法較小，有助于臨床上對病因不明、抗生素暴露、免疫缺陷等患者的病原學(xué)診斷，為精準(zhǔn)治療帶來希望。但mNGS是否可以替代傳統(tǒng)檢測方法，目前仍缺乏更多真實(shí)世界的研究。本研究不足之處在于樣本量過少，期望臨床能進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量統(tǒng)計(jì)分析，增加結(jié)論的可靠性。