基于RAS/RAF/ERK信號通路探討益氣生肌合劑對壓力性損傷大鼠創(chuàng)面微小血管生成的作用機(jī)制

肖思民， 徐鳳英， 廖若夷

壓力性損傷也稱為褥瘡或壓力性潰瘍[1]，尤其好發(fā)于老年臥床患者，嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量，亦給其身心帶來著巨大的痛苦[2]。在多年的臨床實踐中應(yīng)用益氣生肌合劑在壓力性損傷患者的創(chuàng)面修復(fù)中取得了顯著穩(wěn)定的療效，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步證實。本實驗研究以前期預(yù)實驗為基礎(chǔ)，根據(jù)模擬缺血再灌注法建立壓力性損傷大鼠模型，基于RAS/RAF/ERK信號通路進(jìn)一步探討益氣生肌合劑對壓力性損傷大鼠模型創(chuàng)面修復(fù)及微小血管生成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF清潔級雌性BALB/c大鼠32只，周齡為8～12周，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(湘 )2019-0004]。

1.2 實驗藥物 益氣生肌合劑為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具體藥物組成：黃芪、黨參、地黃、血余炭、當(dāng)歸、爐甘石、蜂蜜、紫草、白芷、地榆，由我院制劑室提供（批號：20210105，規(guī)格100 g/瓶）；三乙醇胺乳膏[法國bia fine act公司生產(chǎn)，注冊號：（進(jìn)）H20120425，規(guī)格：46.5 g/支 ]。

1.3 主要試劑與儀器 Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF一抗（美國Cell Signaling Technology公司）；PBS（美國Hyclone公司）；總RNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR（RT-PCR）Ras、Raf-1、ERK1/2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)試劑盒（武漢博士德生物公司）；激光多普勒血流灌注散斑成像儀（瑞典Perimed公司）；電鏡（德國LEICA公司）；搖床（江蘇其林貝爾公司）、熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器公司），其余實驗試劑及儀器均由我院實驗室提供。

1.4 壓力性損傷大鼠模型的建立 使用戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行麻醉（80 mg/kg），剃毛后選取大鼠右股薄肌部，參照以往研究構(gòu)建缺血-再灌注的生理反應(yīng)制備壓力性損傷大鼠模型[3]，其中壓力裝置向大鼠施壓模擬“缺血”過程(持續(xù)2.0 h)，釋放壓力模擬“再灌注”過程(持續(xù)0.5 h)，完整的“缺血-再灌注”制備壓力性損傷大鼠模型循環(huán)需用時2.5 h，設(shè)置壓力參數(shù)為34.7 kPa。所有大鼠均實施6個循環(huán)，以制備大鼠出現(xiàn)直徑約1 cm的明顯壓力性紅斑，同時30 min內(nèi)按壓不退色則視為壓力性損傷大鼠模型制備成功。

1.5 動物分組與給藥 隨機(jī)將32只大鼠分為模型對照組、三乙醇胺乳膏組（陽性藥物組）、益氣生肌合劑組（益氣生肌組）、三乙醇胺乳膏+益氣生肌組（聯(lián)合用藥組），每組8只。根據(jù)人與實驗大鼠體質(zhì)量比例[4]計算，設(shè)定為12.98 g/（kg·d），使用生理鹽水加熱充分溶解益氣生肌合劑，制備實驗所用藥液。三乙醇胺乳膏使用方法為2次/d。模型對照組大鼠通過灌胃針灌胃生理鹽水0.4 mL；陽性藥物組大鼠于創(chuàng)面均勻涂抹三乙醇胺乳膏；益氣生肌組大鼠以上述制備的益氣生肌合劑藥液通過灌胃針灌胃0.4 mL；聯(lián)合用藥組為三乙醇胺乳膏外用+益氣生肌合劑灌胃0.4 mL，均連續(xù)用藥8 d。

1.6 觀察指標(biāo)及方法 第8天對大鼠采血，置于4 ℃的低溫下以1 500 r/min離心5 min，血清置于-20 ℃冰箱待檢。斷頸處死大鼠，使用無菌儀器在大鼠創(chuàng)面受壓中心部位肌肉組織取材約1 g，并進(jìn)行HE染色。觀察各組大鼠造模后及藥物干預(yù)后第3、5、8天的創(chuàng)面面積及創(chuàng)面情況。用激光多普勒血流灌注散斑成像儀檢測各組大鼠創(chuàng)面血流灌注量水平，計算各組大鼠的微血管密度(microvessel density，MVD)值。Western blotting及實時定量PCR檢測創(chuàng)面受壓中心部位肌肉組織中Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF等蛋白及mRNA的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）描述，符合正態(tài)分布和方差齊性，采用完全隨機(jī)設(shè)計多樣本單因素方差分析；計數(shù)資料采用例（%）表示，比較用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組壓力性損傷大鼠模型創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察及創(chuàng)面愈合率比較 干預(yù)8 d后，模型對照組大鼠仍可見壓力性損傷性腐肉，創(chuàng)面潮濕，與之相比，陽性藥物組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面均呈明顯愈合趨勢，其中聯(lián)合用藥組愈合效果最佳（P＜0.05），見表1、表2及圖1。

圖1 造模第5天各組大鼠創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察

表1 各組大鼠創(chuàng)面情況比較

表2 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.2 各組壓力性損傷大鼠模型創(chuàng)面組織病理學(xué)情況 模型對照組大鼠受壓中心部位組織存在大量的免疫細(xì)胞浸潤，可見明顯的肌肉纖維壞死碎片、空泡變性、肉芽組織雜亂增生、纖維腫大、橫斷、溶解等情況；其余組可見一定程度的免疫浸潤，偶見受壓部位組織纖維腫大、橫斷、溶解、空泡化等情況；聯(lián)合用藥組可見輕度免疫浸潤以及少量的成纖維細(xì)胞，組織纖維斷裂存在不同程度的改善，基本未見空泡化現(xiàn)象，見圖2。

圖2 各組大鼠組織病理學(xué)情況(HE， ×100)

2.3 各組壓力性損傷大鼠模型血流灌注量及微小血管密度比較 造模第1天，各組大鼠模型的血流灌注量及微小血管密度無顯著差異（P＞0.05），造模第8天，模型對照組的血流灌注量及微小血管密度顯著小于其他組，其中聯(lián)合用藥組效果最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血流灌注量及微小血管密度比較

2.4 各組壓力性損傷大鼠模型創(chuàng)面組織Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)情況 陽性藥物組、益氣生肌組、聯(lián)合用藥組均可顯著促進(jìn)大鼠皮損組織的Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，且聯(lián)合用藥組效果最優(yōu)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3，表3，表4。

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表達(dá)水平比較

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的mRNA表達(dá)水平比較

圖3 Western blotting檢測Ras、Raf-1、ERK1/2及VEGF的蛋白表達(dá)

3 討論

壓力性損傷大多因機(jī)體較長時間承受壓力，日久則出現(xiàn)受壓局部持續(xù)的缺血缺氧狀態(tài)，肌肉皮膚失于滋養(yǎng)，導(dǎo)致氣滯血瘀，加之重壓摩擦破潰，終致反復(fù)感染[5]。臨床表現(xiàn)多為局部紅腫壞死潰瘍，創(chuàng)面遷延難愈等[6]，嚴(yán)重降低了患者的行動及自理能力。本病多以氣虛為本，蘊毒為標(biāo)，其治療總體原則為扶正祛邪，標(biāo)本兼治[7]。本病較高的治療及護(hù)理成本使患者家庭及社會負(fù)擔(dān)沉重，針對本病發(fā)現(xiàn)新的、安全、廉價、高效的治療手段已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點。

現(xiàn)階段對壓力性損傷進(jìn)行的基礎(chǔ)研究較少[8]。本病其因病變部位組織微循環(huán)已破壞殆盡，血運極差，創(chuàng)面難以快速愈合，不僅嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，亦給醫(yī)護(hù)工作造成了極大的困難[9]。研究表明，RAS/RAF/ERK信號通路是參與組織損傷愈合過程的主要信號通路之一，其能夠調(diào)控VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平，貫穿于整個血管新生的過程，發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。封悅等[11]研究顯示，VEGF能夠參與到壓力性損傷修復(fù)愈合諸多細(xì)胞生物學(xué)功能之中，VEGF所參與的各種細(xì)胞功能需通過與其受體VEGFR進(jìn)行結(jié)合才可發(fā)揮，其中最重要的調(diào)控信號通路之一是RAS/RAF/ERK信號通路。RAS/RAF/ERK信號通路可激活下游的VEGF途徑，調(diào)控多種細(xì)胞因子調(diào)控壓力性損傷的創(chuàng)面血管新生，促進(jìn)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移[12-13]。因此研究該信號通路在壓力性損傷及其生理狀態(tài)下的具體作用機(jī)制，從而為本病治療提供了新的思路及方法，是值得去嘗試的重要研究方向。

益氣生肌合劑是我院治療壓力性損傷的優(yōu)秀院內(nèi)制劑，其由名方補中益氣湯化裁而來，功效益氣托毒、活血生肌，針對壓力性損傷氣虛毒蘊的病因病機(jī)，可有效改善局部組織損傷，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，同時方中藥物均為常見藥物，方便易得，價位合理，操作簡單，未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，因此適于基層臨床應(yīng)用。本研究結(jié)果表明，相對于單獨使用三乙醇胺乳膏或益氣生肌合劑，聯(lián)合用藥的效果更佳，亦顯示出中西醫(yī)結(jié)合治療本病的獨特優(yōu)勢。本次實驗通過益氣生肌合劑干預(yù)壓力性損傷大鼠模型，結(jié)果顯示益氣生肌合劑能有效改善壓力性損傷大鼠模型的創(chuàng)面損傷，緩解壓力性損傷病理損害，有效促進(jìn)大鼠創(chuàng)面的血流灌注量及微小血管生成，同時促進(jìn)RAS/RAF/ERK信號通路Ras、Raf-1、ERK1/2、VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)，并與三乙醇胺乳膏聯(lián)合使用起到協(xié)同增效作用。提示益氣生肌合劑可通過激活RAS/RAF/ERK信號通路并促進(jìn)其相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)壓力性損傷病理損害的修復(fù)，可為中西醫(yī)結(jié)合治療壓力性損傷提供新的思路與方法。