2種蛋白肽對(duì)電離輻射損傷小鼠的保護(hù)作用

劉愛青，王海燕，王應(yīng)強(qiáng)，閆 征，李志國，許智敏

（1.北京盛美諾生物技術(shù)有限公司，北京 100062；2.安徽盛美諾生物技術(shù)有限公司，安徽 淮北 235000；3.隴東學(xué)院，農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000）

輻射（radiation）在現(xiàn)實(shí)生活中隨處可見，對(duì)人類造成損傷的主要類型包括X、γ射線等電離輻射[1?3]。電離輻射會(huì)導(dǎo)致造血、免疫、消化、氧化還原系統(tǒng)及生殖等系統(tǒng)的損害，甚至導(dǎo)致死亡[4?5]。加強(qiáng)輻射防護(hù)，預(yù)防或減輕放射病己成為當(dāng)今亟待解決的重要課題[6]。日前，已使用的抗輻射藥有氨磷汀、碘化鉀等，但均存不同程度的局限性[7]，且合成抗輻射劑價(jià)格昂貴，大都會(huì)引起一定的副作用，臨床和實(shí)際應(yīng)用受到很大限制[8]。因此，天然輻射防護(hù)劑在現(xiàn)代醫(yī)藥保健行業(yè)中日益得到重視，研究者側(cè)重于從可食用的天然植物、動(dòng)物中開發(fā)高效抗輻射損傷的產(chǎn)品。

研究表明，一些植物提取物和小分子生物活性肽能通過免疫調(diào)節(jié)、刺激骨髓造血機(jī)能以及提高氧化酶活力并抑制自由基產(chǎn)生，對(duì)輻射所致的造血功能、免疫器官損傷和氧化損傷提供保護(hù)作用，具有較好的防輻射損傷功能[9?13]。但很多提取物和生物活性肽因?yàn)榭酀y以入口，因此作者在眾多植物和動(dòng)物來源的生物活性肽中，篩選出兩種口感最好的生物活性肽—菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽進(jìn)行抗輻射防護(hù)作用研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：膠原蛋白肽研究主要集中在抗氧化、抗衰老以及改善骨質(zhì)疏松方面[14?17]；菠蘿蜜營養(yǎng)成分豐富且富含多糖、酚類化合物、類胡蘿卜素等功能活性成分[18?21]。郝云濤等[22]對(duì)菠蘿蜜低聚肽進(jìn)行過部分研究。而膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽對(duì)電離輻射輔助保護(hù)作用的全面研究較少，本文主要依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020版）（征求意見稿）》的標(biāo)準(zhǔn)，通過60鈷γ射線照射BALB/c小鼠，照射前后采用膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽干預(yù)BALB/c小鼠，從五個(gè)方面系統(tǒng)探究了膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽對(duì)電離輻射損小鼠的保護(hù)作用，并對(duì)二者作用效果進(jìn)行了對(duì)比，為選擇有效易得，價(jià)格親民、口感良好的防輻射食品提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜蛋白肽 北京盛美諾生物技術(shù)有限公司提供，來源：菠蘿蜜果肉和須粉碎后酶解混合物，蛋白肽含量9.0%，淡黃色粉末，可市場化銷售的食品原料；膠原蛋白肽 北京盛美諾生物技術(shù)有限公司提供，來源：羅非魚魚鱗，100%蛋白肽（以干基計(jì)算），白色至乳白色粉末，可市場化銷售的食品、保健品原料；雌性小鼠 選用北京華阜康生物科技股份有限公司繁殖的18～22 g昆明健康SPF級(jí)雌性小鼠288只，飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF級(jí)動(dòng)物室（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0038；維持飼料 由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)；血紅蛋白測試液測試盒、SOD測試盒、8羥基脫氧鳥苷試劑盒 南京建成生物工程研究所；CaCl2國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HClO4天津鑫源化工。

T-1000型電子天平 美國雙杰；BS223S型電子天平、BS2202S型電子天平 德國賽多利斯；UV2600型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津；MEK-6318K型血液分析儀、MEK-640血常規(guī)稀釋液、MEK-680溶血?jiǎng)?日本光電工業(yè)株式會(huì)社；HFY-1A 沽源控制臺(tái)、HFY-601 固定式多路 Xγ劑量儀60Coγ射線輻射源 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院；Thermo全波掃描多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與建模 飼養(yǎng)一周適應(yīng)后，288只小鼠隨機(jī)分為四批（每批用于一個(gè)功能指標(biāo)的評(píng)價(jià)），每批6組，每組12只。每組設(shè)計(jì)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、菠蘿蜜蛋白肽低、高劑量組（0.20、0.80 g/kg BW）以及膠原蛋白肽低、高劑量組（0.53、1.6 g/kg BW）。每日一次經(jīng)口給予小鼠受試品26 d后，除空白對(duì)照組，其它各組接受60鈷γ射線全身輻射，輻射后繼續(xù)灌胃干預(yù)。分別檢測外周血白細(xì)胞數(shù)（照射劑量3.5 Gy，照射前、照射后第3 d、第14 d）、骨髓細(xì)胞DNA含量和血清8羥基脫氧鳥苷的含量（照射劑量3.5 Gy，照射后第3 d）、血清溶血素（照射劑量1 Gy，照射后第7 d），血中超氧化物歧化酶（SOD）活性（照射劑量7 Gy，照射后第7 d）。小鼠灌胃體積為10 mL/kg BW，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組均用無菌純化水代替受試物，每日灌胃量與各受試物組相同。各組均給予維持飼料。實(shí)驗(yàn)中使用無菌水配制兩種蛋白肽。菠蘿蜜蛋白肽灌胃劑量參考郝云濤等[23]相關(guān)研究數(shù)據(jù)；根據(jù)人體推薦劑量 10倍，30倍分別設(shè)計(jì)膠原蛋白肽低劑量組和高劑量組。

1.2.2 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020版）》二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法進(jìn)行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，照射劑量選擇3.5 Gy。于照射前、照射后第3 d、照射后第14 d分別進(jìn)行三次采末梢血20 μL，加入2.0 mL稀釋液中，混勻后，于血液分析儀上進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。照射后3 d輻射模型對(duì)照組的白細(xì)胞數(shù)分別與照射前進(jìn)行自身比較，差異有顯著性，則判定輻射損傷模型成立；任一時(shí)間點(diǎn)、任一劑量組與輻射模型對(duì)照組比較，白細(xì)胞總數(shù)增多，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.2.3 骨髓細(xì)胞DNA含量以及血清DNA損傷修復(fù)

1.2.3.1 骨髓細(xì)胞DNA含量 依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020版）》二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法進(jìn)行骨髓細(xì)胞DNA含量測定實(shí)驗(yàn)，照射劑量選擇3.5 Gy，于照射后第3 d，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剝離出股骨，利用紫外分光光度計(jì)法測定DNA含量。具體方法參照李解的研究方法[24]。任一劑量組與模型對(duì)照組比較，骨髓DNA含量增多，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.2.3.2 DNA損傷修復(fù) 8羥基脫氧鳥苷是目前公認(rèn)的一種評(píng)價(jià)DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)的生物標(biāo)志物，于照射后第3 d，通過眼球采血，離心后取上清液，利用ELISA法，按照試劑盒說明書對(duì)血清中8羥基脫氧鳥苷含量進(jìn)行檢測。

1.2.4 血清溶血素（半數(shù)溶血值，HC50） 依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020版）》二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法進(jìn)行血清溶血素實(shí)驗(yàn)，照射劑量選擇1 Gy，于照射后第7 d，進(jìn)行血清溶血素的測定。具體方法參照劉雅萍[25]的方法以及試劑盒檢測說明書。任一劑量組與模型對(duì)照組比較，血清半數(shù)溶血值增多，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.2.5 血中超氧化物歧化酶（SOD）活性 依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)方法（2020版）》二十三、對(duì)電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法進(jìn)行血中超氧化物歧化酶（SOD）活性實(shí)驗(yàn)，照射劑量選擇7 Gy，于照射后第7 d，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體方法參照劉雅萍[25]方法以及試劑盒檢測說明書。任一劑量組與模型對(duì)照組比較，血中SOD活性增強(qiáng)，差異有顯著性，則可判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示 ( X±SD)，采用SPSS11.0軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：空白對(duì)照組與模型對(duì)照組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；劑量組與模型對(duì)照組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示具有顯著差異性，P<0.01表示具有極其顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種蛋白肽對(duì)小鼠體重的影響

由表1可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的蛋白肽26 d后，小鼠體重在各劑量組與模型對(duì)照組間比較，均無顯著性差異（P>0.05）；模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，無顯著性差異（P>0.05），即兩種蛋白肽對(duì)小鼠體重?zé)o不良影響。此期間各組動(dòng)物毛發(fā)光滑，密度均勻，無脫毛現(xiàn)象，精神活躍，食欲正常，未發(fā)現(xiàn)四肢有腫脹等情況。

表1 2種蛋白肽對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effects of two protein peptides on body weight of mice

2.2 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

由表2可見，照射前各劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與模型對(duì)照組間比較，均無顯著性差異（P>0.05）；模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，無顯著性差異（P>0.05），說明各組間外周血白細(xì)胞數(shù)較為均衡。3.5 Gyγ射線全身一次性照射后第3 d，與照射前進(jìn)行自身比較，模型對(duì)照組的白細(xì)胞數(shù)降低，有顯著性差異（P<0.001），即輻射損傷模型建立成功。照射后第3 d、14 d，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.001）。照射后第3 d，與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）；膠原蛋白肽低劑量組、高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。輻射后第14 d，與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）；膠原蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05），而且菠蘿蜜蛋白肽高劑量組要優(yōu)于膠原蛋白肽高劑量組。膠原蛋白肽的低高劑量組對(duì)輻射后小鼠的外周血白細(xì)胞均有顯著提升，這與膠原蛋白肽具抗氧化[14]、增強(qiáng)免疫力的作用有關(guān)[26]；菠蘿蜜蛋白肽僅有高劑量組對(duì)輻射后小鼠的外周血白細(xì)胞有作用，應(yīng)和菠蘿蜜蛋白肽自身蛋白肽的含量低有關(guān)。

表2 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Table 2 Effects of two protein peptides on peripheral blood white blood cells count of mice after radiation

此批實(shí)驗(yàn)小鼠輻照后首天，與空白對(duì)照比較，模型對(duì)照組以及其它受試物組小組均表現(xiàn)出毛發(fā)稍有豎立，食欲一般，動(dòng)作遲緩的現(xiàn)象，但并無四肢腫脹、死亡等情況；輻照后第3 d模型組和各受試物組小鼠食欲、行動(dòng)及精神狀態(tài)有一定改善，但和空白對(duì)照組還有差距；輻照后第14 d各種體態(tài)接近空白對(duì)照組。

2.3 兩種蛋白肽對(duì)照射后小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響以及對(duì)DNA損傷的修復(fù)

2.3.1 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響 由表3可見，輻射后第3 d，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量顯著降低（P<0.001）；與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量（P<0.05）；而膠原蛋白肽劑量組則輕微地降低小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量。

表3 2種蛋白肽對(duì)照射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響Table 3 Effect of two protein peptides on DNA content of irradiated mice's bone marrow cells

2.3.2 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠DNA損傷修復(fù)的影響 由表4可見，輻射后第3 d，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量顯著升高（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組和膠原蛋白肽高劑量組能顯著降低小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量（P<0.01），這說明菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽對(duì)輻照造成的DNA損傷具有一定的修復(fù)作用。

表4 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠DNA損傷修復(fù)的影響Table 4 Effect of two protein peptides on repair of DNA in irradiated mice

菠蘿蜜蛋白肽在短時(shí)間對(duì)骨髓細(xì)胞DNA含量有顯著作用應(yīng)與其組成成分有關(guān)系，因其是菠蘿蜜肉和須酶解后混合物，除蛋白肽外，還含有多糖、多酚、類胡蘿卜素[21]，而朱科學(xué)[27?29]、Fang等[30]、Yao等[31]研究顯示菠蘿蜜中營養(yǎng)成分多糖、多酚具有較好的抗氧化、抗炎活性；Stahl等[32]研究顯示菠蘿蜜類胡蘿卜素對(duì)預(yù)防癌癥、炎癥至關(guān)重要，所以分析菠蘿蜜蛋白肽能短時(shí)間升高照射后小鼠骨髓細(xì)胞的DNA含量，應(yīng)與這些營養(yǎng)物質(zhì)的活性作用有關(guān)。膠原蛋白肽劑量組反而有輕微降低小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量，應(yīng)與其成分單一具有一定的關(guān)系，也可能與照射后灌胃干預(yù)時(shí)間短有關(guān)系。菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽能顯著降低小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量，應(yīng)與兩個(gè)產(chǎn)品含有的小分子肽具有抗氧化、抗炎和細(xì)胞修復(fù)作用有關(guān)。

此批實(shí)驗(yàn)小鼠輻照后首天，與空白對(duì)照比較，模型對(duì)照組以及其它受試物組小組均表現(xiàn)出毛發(fā)稍有豎立，食欲一般，動(dòng)作遲緩的現(xiàn)象，但并無四肢腫脹、死亡等情況；輻照后第三天模型組和各受試物組小鼠食欲、行動(dòng)及精神狀態(tài)有一定改善，但和空白對(duì)照組還有差距。

2.4 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠血清溶血素含量的影響

由表5可見，照射后第7 d，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清溶血素含量顯著降低（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠血清溶血素含量（P<0.05）。而膠原蛋白肽低、高劑量組均能升高血清溶血素的含量，但無顯著性差異（P>0.05）其原因可能與2.3結(jié)果分析原因相同。

表5 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠血清溶血素含量的影響Table 5 Effect of two protein peptides on serum hemolysin content of irradiated mice

此批實(shí)驗(yàn)小鼠輻照前后各劑量組和空白對(duì)照比較，食欲、精神、行動(dòng)、毛發(fā)未觀察到明顯變化。

2.5 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影響

由表6可見，照射后第7 d，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）活性無顯著性差異（P>0.05）；各劑量組小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）活性與模型對(duì)照組比較，均無顯著性差異（P>0.05），表明無論γ射線照射處理，還是2種蛋白肽對(duì)小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性均無影響。菠蘿蜜蛋白肽實(shí)驗(yàn)結(jié)果與郝云濤等[23]研究結(jié)果不一致的可能原因：一是菠蘿蜜蛋白肽的來源本文是菠蘿蜜肉和須，而其是菠蘿蜜肉和種子；二是和輻照的劑量不同有關(guān)系；三是照射后灌胃干預(yù)的時(shí)間不同。膠原蛋白肽實(shí)驗(yàn)組無顯著影響應(yīng)與照射后灌胃干預(yù)時(shí)間短有關(guān)系。

表6 2種蛋白肽對(duì)照射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性的影響Table 6 Effect of two protein peptides on superoxide dismutase(SOD) activity of irradiated mice’s blood

此批實(shí)驗(yàn)首日照射后模型對(duì)照組和各受試物組的小鼠與空白對(duì)照組的小鼠相比較，明顯表現(xiàn)出食欲不好、精神萎靡、行動(dòng)遲緩、毛發(fā)豎立，而且照射后七天稍有好轉(zhuǎn)，但和其它批實(shí)驗(yàn)小鼠相比較食欲、精神、行動(dòng)恢復(fù)速度都較慢，應(yīng)和照射劑量大有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究說明菠蘿蜜蛋白肽對(duì)電離輻射損傷小鼠有輔助保護(hù)作用：與模型對(duì)照組比較，菠蘿蜜蛋白肽組和膠原蛋白肽組都可以顯著升高外周血白細(xì)胞數(shù)、小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量（P<0.05），極顯著地降低了輻照后小鼠血清中8羥基脫氧鳥苷的含量（P<0.01）；同時(shí)顯著升高血清溶血素（P<0.05）。因此，本研究為抗輻射產(chǎn)品配方開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。