四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中理化因子與真菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

張桂容，馮潔雅,2，蔡 吉，附俊杰，李 麗, ，劉 軍，溫雪瓶，曹 榮

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.豐谷酒業(yè)有限責(zé)任公司，四川 綿陽(yáng) 621023；3.四川太源井醋業(yè)有限公司，四川 自貢 643000）

四川曬醋是麩醋的一類，多產(chǎn)于川南地區(qū)。四川曬醋是以麩皮為主料，輔以多種中草藥制曲為發(fā)酵劑，經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵、曬醅、曬醋液、滅菌等多道工序釀造而成的具有色澤棕褐、醇香回甜、酸味柔和、濃稠等獨(dú)特風(fēng)格的食醋[1?2]。曬醋采用傳統(tǒng)的生料固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵過(guò)程中糖化、酒化、醋化在一個(gè)發(fā)酵池內(nèi)同時(shí)進(jìn)行（即三邊同池發(fā)酵），多種微生物交相演替，共同構(gòu)成曬醋的獨(dú)特風(fēng)味。因此，研究曬醋發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落，對(duì)于曬醋風(fēng)味形成、工藝改進(jìn)、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)等具有重要意義。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)因其通量高、速度快、準(zhǔn)確度高、無(wú)需建庫(kù)、簡(jiǎn)便高效等特點(diǎn)[3?4]廣泛應(yīng)用于食醋發(fā)酵過(guò)程的微生物群落研究中，王宗敏[5]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鎮(zhèn)江香醋的微生物群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳桿菌、醋酸桿菌、曲霉屬、鏈格孢霉屬在醋酸發(fā)酵過(guò)程占優(yōu)勢(shì)地位；劉廷銳[6]的研究表明：四川麩醋中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌也是乳桿菌屬、醋桿菌屬，并結(jié)合理化因子進(jìn)行CCA分析發(fā)現(xiàn)酒度、酸度與發(fā)酵過(guò)程具有一定相關(guān)性。ZHU等[7]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)山西老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌群落的演替進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第0 d至第4 d以泛菌屬（Pantoea）、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、根瘤菌屬（Rhizobium）為主，發(fā)酵第5～21 d以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主，發(fā)酵第22～26 d以醋酸菌屬（Acetobacter）、Komagataeibacter和Kroppenstedtia為主。崔寧波[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)生料釀醋發(fā)酵過(guò)程中以釀酒酵母和黑曲霉為優(yōu)勢(shì)真菌。目前，對(duì)于四川曬醋的細(xì)菌群落已有研究[9]，而對(duì)于四川曬醋的真菌群落研究較少。從以往研究來(lái)看，真菌是食醋發(fā)酵過(guò)程中一類重要的微生物，包括酵母菌、曲霉、青霉等，在發(fā)酵過(guò)程中不僅起著糖化、液化等作用，還與食醋風(fēng)味、品質(zhì)等緊密相關(guān)。比如：酵母菌不僅能產(chǎn)生醇類、酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，還能產(chǎn)生四甲基吡嗪的前體物質(zhì)—乙偶姻[10]。王宗敏[5]通過(guò)O2PLS相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中真菌與一部分氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)；浙江玫瑰醋發(fā)酵過(guò)程中紅曲霉屬、假絲酵母屬對(duì)醇類、醛類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)有重要作用[11]?？梢?jiàn)真菌在食醋發(fā)酵過(guò)程中起重要作用。

本文采用ITS高通量測(cè)序研究了四川曬醋在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的真菌群落變化規(guī)律，并探究了理化因子的變化規(guī)律及不同發(fā)酵階段的差異微生物。通過(guò)冗余分析探究真菌群落動(dòng)態(tài)演替與理化因子的關(guān)系，掌握真菌變化與代謝產(chǎn)物以及產(chǎn)品質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)，為曬醋的人工調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

樣品 采集于四川某曬醋廠。從翻醅車間的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程取樣，從發(fā)酵第1 d開(kāi)始每天定時(shí)取樣，樣品包括第1 d （F1）、第2 d （F2）、第3 d （F3）、第4 d（F4）、第5 d （F5）、第6 d （F6）、第7 d （F7）、第8 d（F8）、第9 d （F9）、第10 d （F10）、第11 d （F11）、第12 d （F12）、第13 d （F13）、第14 d （F14）、第15 d（F15）和第16 d （F16）的醋醅，共計(jì)16個(gè)樣品。固定10個(gè)取樣點(diǎn)，從醋醅表面向下10～30 cm處取樣，將樣品混合均勻，保存于?20 ℃冰箱中，采集結(jié)束后，運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，保存于?70 ℃冰箱中，待檢測(cè)；土壤DNA提取試劑盒（Omega E.Z.N.A.? Soil DNA Kit） OMEGA；Agarose、TAE Invitrogen ；Marker

Takara；甲醛溶液、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、甲醛溶液、3，5-二硝基水楊酸、苯酚 均為分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；亞硫酸鈉、四水酒石酸鉀鈉 均為分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司。

AT-710 pH計(jì) 京都電子KEM；MB25水分測(cè)定儀 OHAUS；T6分光光度計(jì) 新世紀(jì)，普析通用；NC2000 Nanodrop Thermo Scientific；DYY-6C電泳儀 北京六一；BG-gdsAUTO（130） 凝膠成像系統(tǒng) 北京百晶；Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化因子檢測(cè)方法

1.2.1.1 pH的測(cè)定 取10 g醋醅，加入90 mL去離子水，攪拌均勻，浸泡30 min后，過(guò)濾，使用pH計(jì)測(cè)定濾液的pH。

1.2.1.2 溫度的測(cè)定 使用溫度計(jì)插入醋醅表層以下10 cm處，測(cè)定溫度。

1.2.1.3 總酸的測(cè)定 稱取10 g醋醅，用100 mL容量瓶定容，浸泡3 h，過(guò)濾醋醅，取20 mL的濾液，參照GB 12456-2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》中pH計(jì)電位滴定法測(cè)定總酸含量。

1.2.1.4 氨基態(tài)氮的測(cè)定 參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中酸度計(jì)法測(cè)定醋醅的氨基態(tài)氮含量。

1.2.1.5 水分的測(cè)定 取2 g左右的醋醅放入水分測(cè)定儀中測(cè)定醋醅的水分含量。

1.2.1.6 還原糖的測(cè)定 稱量5 g 樣品，加蒸餾水50 mL，45 ℃水浴2 h，冷卻后定容于100 mL容量瓶中，過(guò)濾后取濾液，用DNS法[12]測(cè)定還原糖含量。

1.2.2 醋醅微生物基因組DNA的提取及高通量測(cè)序 醋醅總DNA采用土壤DNA提取試劑盒提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用NanoDrop 2000 測(cè)定DNA純度和含量。通過(guò)PCR擴(kuò)增真菌ITS1（a）序列，引物為ITS5F（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3’）、ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3’），PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、定量后進(jìn)行Illumina MiSeq 測(cè)序，測(cè)序公司為上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司（上海，中國(guó)）。

1.2.3 高通量測(cè)序分析 主要使用QIIME2軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。按照QIIME2 dada2分析流程進(jìn)行序列去引物，質(zhì)量過(guò)濾，去噪（denoise），拼接和去嵌合體等步驟，以100%相似度聚類劃分為ASV，并利用Unite數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 8.0，https://unite.ut.ee/）對(duì)ASV進(jìn)行分類注釋，刪除不能注釋到門(mén)水平的序列，同時(shí)結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，并計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、Simpson指數(shù)、Chao 1指數(shù)及文庫(kù)覆蓋率（Coverage），計(jì)算Bray-Curtis相異性指數(shù)，并對(duì)不同樣本進(jìn)行聚類分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin2018軟件繪制折線圖、柱狀圖，并進(jìn)行真菌樣本的聚類分析，采用SPSS2018軟件進(jìn)行斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)性分析。采用派森諾云平臺(tái)（https://www.genes cloud.cn/login）進(jìn)行主成分分析（PCA）、Lefse分析（Linear discriminant analysis Effect Size，線性判別分析），利用Canon5.0進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川曬醋發(fā)酵過(guò)程中理化因子結(jié)果分析

四川曬醋在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的理化因子變化規(guī)律見(jiàn)圖1與圖2，在曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，pH呈先增加后降低再保持穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，其pH先增加的原因是第1 d將醋母液倒入裝有麩皮的發(fā)酵池后，等待醋母液自然下沉，導(dǎo)致局部pH較低（注：取樣采用多點(diǎn)取樣，由于發(fā)酵池較大，較深（發(fā)酵池規(guī)格：20 m×1.4 m×1 m），倒入醋母液后，發(fā)酵第1 d醋母液自然下沉，分布不均勻，所以第1 d的pH較低），第2 d翻醅后，醋母液與麩皮翻拌均勻使pH上升，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，pH逐漸降低，第8 d之后，pH基本保持在4.2左右?？偹岬暮渴菣z驗(yàn)醋醅是否成熟的一個(gè)重要指標(biāo)[13]，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總酸的含量先增加后保持穩(wěn)定。溫度是固態(tài)發(fā)酵中的重要因素，溫度過(guò)高，不利于低溫微生物生長(zhǎng)；溫度過(guò)低，微生物生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)效率低。在發(fā)酵過(guò)程中，第2～3 d溫度迅速上升，同時(shí)pH迅速降低，總酸含量迅速上升，說(shuō)明微生物迅速生長(zhǎng)，使醋醅溫度升高，由于每天的翻醅操作，發(fā)酵后期的醋醅溫度維持在40 ℃左右。

圖1 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中溫度、pH、總酸含量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of temperature, pH, total acid content in Sichuan sun vinegar during the solid-state fermentation

圖2 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中水分、氨態(tài)氮、還原糖含量動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of moisture, ammonia nitrogen and reducing sugar content in Sichuan sun vinegar during the solid-state fermentation

如圖2所示，經(jīng)翻醅操作后，醋醅中麩皮與醋母液混合均勻，醋醅的水分含量基本保持在60%左右。還原糖含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵前期的霉菌等微生物分解淀粉、糊精等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生了大量的還原糖，在發(fā)酵后期，還原糖被微生物利用，其含量逐漸降低。氨態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，呈逐漸上升的趨勢(shì)，發(fā)酵第1～10 d增加迅速，發(fā)酵第11～16 d增加緩慢。在發(fā)酵前期，氨態(tài)氮含量增長(zhǎng)較快，可能與產(chǎn)蛋白酶的微生物生長(zhǎng)活躍有關(guān)；發(fā)酵后期，微生物數(shù)量減少，酶活下降以及各種氨基酸參與風(fēng)味物質(zhì)的合成，使氨基態(tài)氮含量增長(zhǎng)緩慢。

2.2 樣品的測(cè)序結(jié)果

醋醅中真菌群落測(cè)序深度>10000條序列，16個(gè)樣本共獲得62101條序列，因?yàn)镮TS區(qū)域在不同物種間的變異度較大，測(cè)序所得reads長(zhǎng)度位于120～400 bp。序列經(jīng)過(guò)過(guò)濾和質(zhì)量控制后，每個(gè)醋醅樣本可用的測(cè)序序列均在10000條以上均達(dá)到要求的測(cè)序深度。為得到醋醅樣本測(cè)序結(jié)果中的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性等信息，本文采用100%相似度水平對(duì)優(yōu)化過(guò)的ITS1序列進(jìn)行歸類，發(fā)現(xiàn)醋醅中的真菌群落可以劃分為1271個(gè)擴(kuò)增子序列變異（ASVs, amplicon sequence variants）。

2.3 樣品間α多樣性分析

由表1可知，各醋醅樣本序列覆蓋率均在0.9999左右，表明樣本覆蓋率高，測(cè)序深度合適；Chao1指數(shù)可以表示群落的豐富度，其值在15.90～485.26之間波動(dòng)，說(shuō)明真菌群落物種較豐富；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落物種多樣性越高；Shannon指數(shù)/Simpson指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。Shannon指數(shù)/Simpson指數(shù)在2.93～6.38之間變化，說(shuō)明醋醅的真菌群落不斷發(fā)生變化。在發(fā)酵第1 d至發(fā)酵第12 d，真菌多樣性變化較?。话l(fā)酵第13 d，其真菌多樣性最高，說(shuō)明第13 d的真菌種類豐富，隨后，發(fā)酵第14 d至發(fā)酵16 d多樣性略有降低。

表1 每個(gè)醋醅樣本的真菌群落測(cè)序情況及α多樣性統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of fungal community sequencing and α diversity in each cupei sample

2.4 四川曬醋醋醅的門(mén)水平的真菌群落分析

經(jīng)過(guò)與Unite數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，從圖3中可以發(fā)現(xiàn)在分類學(xué)上，翻醅車間的醋醅中的真菌菌群歸屬于9個(gè)門(mén)，在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程第1～8 d，子囊菌門(mén)（Ascomycota）占主導(dǎo)地位，發(fā)酵第9～16 d，毛霉門(mén)（Mucoromycota）豐度增加，與子囊菌門(mén)（Ascomycota）共同作為優(yōu)勢(shì)門(mén)。子囊菌門(mén)（Ascomycota）的相對(duì)豐度在發(fā)酵過(guò)程中整體呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵第1～8 d其相對(duì)豐度由99.9%下降至93.8%，發(fā)酵第9 d其相對(duì)豐度迅速下降至68.9%，發(fā)酵9～16 d其相對(duì)豐度在68.9%～23.4%范圍內(nèi)波動(dòng)變化。毛霉門(mén)（Mucoromycota）在發(fā)酵1～8 d相對(duì)豐度很低（小于10%），發(fā)酵至9 d其相對(duì)豐度增加至28.1%，隨后呈增加趨勢(shì)，其相對(duì)豐度保持在50%左右。擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）在發(fā)酵第1～12 d相對(duì)豐度較低，小于2%，在發(fā)酵第13、14 d其相對(duì)豐度最高達(dá)12%～19%，發(fā)酵第15～16 d降低至2%～7%。被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）的相對(duì)豐度較低，保持在0%～0.6%左右；其余門(mén)類含量低（<0.1%）。

圖3 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中真菌群落在門(mén)水平的分布Fig.3 Distribution of fungal community at phylum level during solid-state fermentation of Sichuan sun vinegar

2.5 四川曬醋醋醅的屬水平的真菌群落分析

經(jīng)過(guò)與Unite 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，醋醅樣品的真菌群落共299個(gè)屬。將樣品中相對(duì)豐度位于前25位的菌群繪制成微生物群落分布柱形圖。從圖4可以看出，畢赤酵母屬（Pichia）和橫梗霉屬（Lichtheimia）的兩個(gè)屬的微生物在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度較大。畢赤酵母屬（Pichia）歸屬于子囊菌門(mén)酵母目，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵第1～8 d相對(duì)豐度保持在90%以上；發(fā)酵第9～16 d，其相對(duì)豐度呈波動(dòng)趨勢(shì)下降，在18%～66%范圍內(nèi)波動(dòng)。畢赤酵母屬（Pichia）可能是由于酸性環(huán)境的壓力使相對(duì)豐度逐漸降低。橫梗霉屬（Lichtheimia）歸屬于毛霉門(mén)，在發(fā)酵前3 d相對(duì)豐度低，從第4 d到第8 d其相對(duì)豐度逐漸增加至7%左右，第9～12 d，其相對(duì)豐度保持在27%～50%范圍內(nèi)，第13 d降低至5%，后期又保持在48%～62%范圍內(nèi)。說(shuō)明橫梗霉屬（Lichtheimia）在發(fā)酵過(guò)程中，生長(zhǎng)較緩慢，翻醅操作使好氧的霉菌豐度呈波動(dòng)變化。

圖4 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中真菌群落在屬水平的分布Fig.4 Distribution of fungal community at genus level during solid-state fermentation of Sichuan sun vinegar

畢赤酵母屬在種水平上主要檢測(cè)到了克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、毛榛畢赤酵母（Pichia mandshurica）、膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）和挪威畢赤酵母（Pichia norvegensis），其中，克魯維畢赤酵母具有產(chǎn)酒精、產(chǎn)酯、耐酸（pH2～4）、耐高溫（44 ℃）等優(yōu)點(diǎn)[14]，畢赤酵母多存在于酒曲和醋曲中[15?16]，在醋醅中比較少見(jiàn)。有研究表明橫梗霉菌具有產(chǎn)α-淀粉酶[17]、葡聚糖酶[18]、木聚糖酶[19]、纖維素酶[20]、蛋白酶[21]和糖化酶的能力。橫梗霉菌能產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，如乙酸、乙醇、苯乙醇和乙酸乙酯等[22]。橫梗霉菌屬在醋醅中也比較少見(jiàn)，常存在于大曲中[23?24]。釀酒酵母相對(duì)豐度很低，可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中溫度高于釀酒酵母的耐受溫度。四川麩醋中的主要真菌是釀酒酵母、覆膜孢酵母、伊薩酵母、黑曲霉等，鎮(zhèn)江香醋的主要真菌是曲霉屬和鏈格孢霉屬；永春老醋發(fā)酵過(guò)程中的主要真菌來(lái)自于酵母綱[25]；赤水曬醋醋酸發(fā)酵階段優(yōu)勢(shì)真菌為曲霉菌屬（Aspergillus）和絲孢酵母菌屬（Trichosporon）[26]；可見(jiàn)不同食醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中起主要作用的真菌各有不同，原因可能是曲、原料、環(huán)境中存在的微生物差異較大。

在發(fā)酵過(guò)程中，除了畢赤酵母屬（Pichia）和橫梗霉屬（Lichtheimia）這兩種相對(duì)豐度較高的屬外，還存在許多相對(duì)豐度較低的物種，比如絲孢酵母屬（Trichosporon）、鏈格孢霉屬（Alternaria）、曲霉菌屬（Aspergillus）和德克酵母屬（Dekkera），其相對(duì)豐度保持在0.1%～4.0%之間，且存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，其余屬相對(duì)豐度小于0.1%（個(gè)別屬在發(fā)酵某天豐度較高）。

2.6 四川曬醋的真菌群落演替的聚類分析

如圖5所示，從對(duì)樣品的聚類結(jié)果，可以看出真菌群落的演替呈現(xiàn)一定規(guī)律，發(fā)酵第1～8 d與其他時(shí)期有較大差異，并且發(fā)酵第9～12 d與發(fā)酵第13～16 d也位于兩個(gè)不同分支。PCA分析發(fā)現(xiàn)（圖6），前個(gè)兩主成分可以代表99.1%的變量信息，真菌的群落變化主要發(fā)生PCA1軸。第13 d的樣品與其他樣品的距離較遠(yuǎn)，從第13 d的群落信息來(lái)看，檢測(cè)到許多低豐度的屬，與其他樣品有較大差別。可能是開(kāi)放的發(fā)酵環(huán)境導(dǎo)致樣品受到了污染，所以后續(xù)分析將第13 d樣品去除。為了研究四川曬醋固態(tài)發(fā)酵的不同發(fā)酵階段，根據(jù)層次聚類結(jié)果，可將四川曬醋固態(tài)發(fā)酵階段分為三個(gè)階段，發(fā)酵第1～8 d為第1階段，發(fā)酵第9～12 d為第2階段，發(fā)酵第14～16 d為第3階段。

圖5 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中真菌群落聚類分析Fig.5 Cluster analysis of fungal community during solid-state fermentation of Sichuan sun vinegar

圖6 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的真菌群落PCA分析Fig.6 PCA analysis of fungal community during solid-state fermentation of Sichuan sun vinegar

2.7 不同發(fā)酵階段標(biāo)志性真菌分析

線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）分析是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識(shí)的分析工具，用于發(fā)現(xiàn)不同生物條件或環(huán)境下的多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征，以及這些特征對(duì)組間差異的影響程度。因此，可以使用LEfSe分析鑒定出不同發(fā)酵階段的標(biāo)志性微生物[27]。由圖7可知，醋醅發(fā)酵第1階段（A）的差異性真菌來(lái)自于畢赤酵母科（Pichiaceae）的畢赤酵母屬（Pichia）和德克酵母屬（Dekkera）以及格孢菌科（Pleosporaceae）的鏈格孢屬（Alternaria）；發(fā)酵第2階段（B）的差異性真菌有毛霉菌科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor）、卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides）；發(fā)酵第3階段（C）的差異性真菌有21種，來(lái)自于毛霉目（Mucorales）、馬拉色菌目（Malasseziales）、散囊菌目（Eurotiales）、被孢霉目（Mortierellales），有傘枝橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）、Lichtheimia ornata、總狀橫梗霉（Lichthe imia ramosa）、Malassezia restricta、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、細(xì)曲霉（Aspergillus gracilis）、紫紅曲霉（Monascus purpureus）和Mortierella elongata等屬。

圖7 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中不同階段的標(biāo)志性真菌分析Fig.7 Analysis of symbolic fungi in different stages during solid-state fermentation of Sichuan sun vinegar

2.8 真菌群落與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

對(duì)翻醅車間的醋醅樣本真菌群落進(jìn)行去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA），得到最大梯度長(zhǎng)度為1.30，具有線性特征。因此，醋醅環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)間的相關(guān)性分析適用線性模型冗余分析（RDA）。從RDA分析結(jié)果表明（圖8），第一軸和第二軸分別解釋微生物群落結(jié)構(gòu)變化的67.66%和7.59%，總解釋度為75.25%，說(shuō)明真菌群落在屬水平上的分布與理化因子關(guān)系密切。氨態(tài)氮、總酸和還原糖對(duì)群落的貢獻(xiàn)度較大，氨態(tài)氮對(duì)真菌群落的解釋率為61.7%（P<0.01），總酸對(duì)真菌群落的解釋率為61.4%（P<0.01），還原糖對(duì)真菌群落的解釋率為40.9%（P<0.01），溫度、水分、pH的解釋率依次減小，且不顯著（P>0.05）。

圖8 四川曬醋不同發(fā)酵階段的真菌群落與理化因子的RDA相關(guān)性分析Fig.8 Redundancy analysis between fungal community and physicochemical properties in different fermentation stages of Sichuan sun vinegar

氨態(tài)氮與發(fā)酵第1～7 d的群落呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)性逐漸減?。话l(fā)酵第8～16 d的群落主要集中在氨態(tài)氮向量的正方向且逐漸遠(yuǎn)離原點(diǎn)，說(shuō)明氨態(tài)氮與發(fā)酵第8～16 d的群落呈正相關(guān)，其相關(guān)性隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明氨態(tài)氮對(duì)真菌群落的影響越來(lái)越大。

總酸對(duì)群落的影響與氨態(tài)氮相似。發(fā)酵前期產(chǎn)蛋白酶的真菌豐度不高，可能主要由芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶分解蛋白質(zhì)，此時(shí)氨態(tài)氮的含量增長(zhǎng)迅速，隨著產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)，醋醅中總酸含量上升，使不耐酸性的芽孢桿菌相對(duì)豐度減少，所以發(fā)酵后期主要由產(chǎn)蛋白酶的真菌來(lái)分解蛋白質(zhì)。

還原糖與發(fā)酵前7 d的真菌群落呈正相關(guān)，且相關(guān)性呈減小趨勢(shì)，發(fā)酵第8 d至第16 d的群落主要在向量的負(fù)方向且逐漸遠(yuǎn)離原點(diǎn)，說(shuō)明發(fā)酵前期產(chǎn)淀粉酶、糖化酶等的真菌豐度較高，使還原糖含量增加，后期由于醋醅酸性環(huán)境的壓力使部分真菌難以生存，相對(duì)豐度減小，同時(shí)使還原糖與真菌群落的相關(guān)性減小。有學(xué)者對(duì)麩醋的細(xì)菌群落、理化指標(biāo)進(jìn)行了冗余分析，得到的結(jié)果表明，溫度是影響細(xì)菌群落變化的主要因素[28]，說(shuō)明真菌和細(xì)菌群落的影響因素有差異。有研究表明翻醅操作通過(guò)影響溫度、氧氣含量等發(fā)酵條件來(lái)影響微生物群落的結(jié)構(gòu)[29]。

根據(jù)Spearman 相關(guān)系數(shù)可知理化指標(biāo)與各個(gè)真菌的相關(guān)性，選擇了豐度前15的真菌進(jìn)行分析，結(jié)果表明（表2），這15種真菌大部分與總酸、氨態(tài)氮、還原糖三個(gè)指標(biāo)具有顯著相關(guān)性（P<0.05），此結(jié)果與RDA結(jié)果相似。與總酸呈顯著正相關(guān)的真菌有橫梗霉菌（Lichtheimia）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀霉（Fusarium）、毛霉屬（Mucor）、Xerochrysium、根毛霉屬（Rhizomucor）、紅曲霉屬（Monascus）、馬拉色霉菌屬（Malassezia），呈顯著負(fù)相關(guān)的真菌有畢赤酵母屬（Pichia）和鏈格孢屬（Alternaria）；與氨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)的真菌包括橫梗霉菌（Lichtheimia）、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀霉（Fusarium）、毛霉屬（Mucor）、Xerochrysium、根毛霉屬（Rhizomucor）、紅曲霉屬（Monascus）、馬拉色霉菌屬（Malassezia），呈顯著負(fù)相關(guān)的真菌包括畢赤酵母屬（Pichia）；與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)的真菌包括橫梗霉菌（Lichtheimia）、毛霉屬（Mucor）、Xerochrysium、根毛霉屬（Rhizomucor）。德克酵母屬（Dekkera）、Phialemoniopsis、Russula、假絲酵母屬（Candida）與總酸等理化因子相關(guān)性均不顯著（P>0.05）。不同真菌與理化因子的相關(guān)性有較大差異，多種真菌共同作用，理化因子與真菌相互影響，通過(guò)控制發(fā)酵環(huán)境，可以影響真菌群落組成，從而改善食醋風(fēng)味。

表2 醋醅樣品中理化指標(biāo)與真菌的Spearman 相關(guān)性Table 2 Spearman correlation coefficients between physicochemical indicators and fungi in cupei samples

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中真菌的組成和演替規(guī)律進(jìn)行了研究，并分析了發(fā)酵過(guò)程中理化因子的變化。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醋醅的pH降低，水分、溫度基本保持穩(wěn)定，總酸、氨態(tài)氮含量先持續(xù)增加后保持穩(wěn)定，還原糖含量先增加后減少。真菌群落的多樣性和均勻性呈現(xiàn)先穩(wěn)定后逐漸增加再降低的趨勢(shì)。根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將發(fā)酵過(guò)程分為3個(gè)階段，且3個(gè)階段的標(biāo)志性真菌不同。畢赤酵母和橫梗霉菌是發(fā)酵過(guò)程中的主要真菌，畢赤酵母屬的相對(duì)豐度在18.3%～99.6%范圍內(nèi)波動(dòng)，橫梗霉菌屬的相對(duì)豐度在0.2%～62.5%范圍內(nèi)變化。此外，冗余分析結(jié)果表明，氨態(tài)氮、總酸是影響真菌群落的主要因素，氨態(tài)氮、總酸與發(fā)酵第1～8 d的真菌群落呈負(fù)相關(guān)，與發(fā)酵第9～16 d的真菌群落呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)理化因子對(duì)曬醋真菌群落的演替有一定的影響，后續(xù)還可以引入更多與真菌生長(zhǎng)相關(guān)的理化因子，如氧氣濃度、酶活等，可能有助于曬醋真菌群落變化的進(jìn)一步探究。